Monitorowanie przebiegu procesu fermentacji alkoholowej

WPROWADZENIE

Fermentacja alkoholowa jest jednym z rodzajów oddychania beztlenowego. W wyniku fermentacji zostaje uwolniona energia zgromadzona w cząsteczkach cukrów i innych związków organicznych. Nie wymaga dostępu tlenu, chociaż niekiedy może przebiegać w jego obecności. Nie korzysta również z cyklu Krebsa czy też łańcucha transportu elektronów, wykorzystuje cząsteczkę organiczną jako ostateczny akceptor elektronów. Fermentacja alkoholowa rozpoczyna się od glikolizy cząsteczki glukozy z utworzeniem dwóch cząsteczek kwasu pirogronowego, które w dalszej kolejności ulegają redukcji do dwóch cząsteczek etanolu. Końcowym produktem fermentacji alkoholowej jest etanol i CO₂. Fermentacja alkoholowa przebiega przy udziale różnych gatunków bakterii i drożdży.

Fermentacja alkoholowa jest procesem biotechnologicznym służącym do wytwarzania etanolu na skalę przemysłową. Wykorzystuje się w niej drożdże Saccharomyces jako biokulturę oraz wodny roztwór cukrów prostych (monosacharydów) jako płynne podłoże hodowlane. Efektywność fermentacji zależy od rodzaju i ilości monosacharydów w roztworze.

Drożdże wykorzystywane w produkcji napojów alkoholowych posiadają względną zdolność do wzrostu w warunkach beztlenowych. Przy pełnym dostępie tlenu drożdże przechodzą na oddychanie tlenowe, którego produktami są CO₂ i woda. Gdy dostęp tlenu jest utrudniony, zachodzi fermentacja z utworzeniem etanolu i CO₂.

Monitorowanie procesu biotechnologicznego – podstawa pomiaru

Próbkę pobraną z fermentatora sączy się w celu usunięcia komórek drożdży. Do przesączu dodaje się kwasu 3,5-dinitrosalicylowego, która zabarwia próbkę na żółto. Kwas 3.5-dinitorsalicylowy ogrzewany w obecności glukozy przekształca się w kwas 3-amino-5-nitrosalicylowy o barwie czerwonobrązowej. Ostateczna barwa roztworu zależy od zawartości glukozy: im więcej glukozy tym ciemniejsza próbka. Intensywność zabarwienia mierzy się za pomocą spektrometru Spectra^TM przy użyciu diody emitującej światło niebieskie.

ODCZYNNIKI

roztwór kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS)

Rozpuścić 10 g DNS w 200 cm³ roztworu NaOH o stężeniu 2 mol dm^-3, mieszając i ogrzewając mieszaninę. Dodać stabilizatora barwnika – roztworu KNaC₄H₄O₆ · 4H₂O sporządzonego przez rozpuszczenie 300 g KNaC₄H₄O₆ · 4H₂O w 500 cm³ wody destylowanej. Zmieszać ze sobą oba roztwory i uzupełnić do objętości 1 dm³ za pomocą wody destylowanej.

ZAGROŻENIA

Kwas 3,5 – dinitrosalicylowy, Xn
R: 20/21/22
S: 24/25

SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Bioreaktor

Przygotuj fermentator do procesu beztlenowego z mobilną biolulturą. Zaopatrz fermentator w wylot dwutlenku węgla.

Podłoże hodowlane (pożywka)

Sporządź 5 kg 13% wodnego roztworu glukozy.

Biokultura

Przygotuj zawiesinę drożdży w wodzie (4 g drożdży na 5 litrów wody). Zawiesina powinna zawierać około 2·10⁸ komórek drożdży na 1 cm³ roztworu.

Podstawowy roztwór standardowy glukozy

Przygotuj wodny roztwór glukozy o stężeniu γ(glu) = 15 mg cm^-3

Przygotowanie próbki do pomiaru

Pobierz 10 cm³ zawartości fermentatora i przesącz próbkę aby usunąć komórki drożdży. Zmieszaj 1 cm³ przesączu z 9 cm³ wody destylowanej

Roztwory do wyznaczenia krzywej wzorcowej

Oznakuj pięć kolbek miarowych o pojemności 100 ml. Napełnij je zgodnie ze wskazówkami w poniższej tabeli:

Kolbka	Podstawowy roztwór standardowy glukozy [cm³]	Woda destylowana [cm³]	Stężenie glukozy w roztworze [mg cm^-3]
1	2	98	0,3
2	3	97	0,45
3	6	94	0,9
4	8	92	1,2
5	10	90	1,5

Po napełnieniu dobrze wymieszaj zawartość kolbki. W tabeli podano uzyskane stężenia masowe glukozy w roztworze.

POMIARY

Przygotuj siedem oznakowanych probówek i napełnij je według wskazówek w poniższej tabeli:

Probówka	Roztwór DNS [cm³]	Woda destylowana [cm³]	1 cm³ roztworu wzorcowego z kolbki nr:	Przesączona próbka z bioreaktora [cm³]
0	1	3
1	1	2	1
2	1	2	2
3	1	2	3
4	1	2	4
5	1	2	4
S	1	2		1

Ogrzewaj napełnione probówki we wrzącej wodzie przez 5 minut. Zajdzie reakcja glukozy z DNS i barwa próbki ulegnie zmianie – stanie się ciemniejsza. Po ochłodzeniu dodaj 6 cm³ wody destylowanej do każdej probówki. Teraz każda z nich zawiera po 10 cm³ barwnego roztworu. Wymieszaj zawartość, odmierz pipetą po 400 µl uzyskanych roztworów i umieść je w kolejnych zagłębieniach blistra. Próbka odniesienia znajduje się w probówce oznaczonej "0". Zmierz transmitancję za pomocą spektrometru Spektra^TM względem próbki odniesienia, używając diody emitującej niebieskie światło.

WYNIKI

Tabela 1: Krzywa wzorcowa (A = f(γ_glu))

γ_glu [mg cm^-3]	0	0,15	0,3	0,45	0,9	1,2	1,5
A	0,52	0,57	0,63	0,65	0,72	0,81	0,89

Wykres 1: Krzywa wzorcowa – zależność absorbancji od stężenia

Tabela 2: Wyniki monitorowania przebiegu fermentacji przez 4 tygodnie

Warunki beztlenowe	A	γ_glu [mg cm^-3]
start	0,85	1,3
1 tydzień	0,68	0,7
2 tydzień	0,65	0,45
3 tydzień	0,60	0,25
4 tydzień	0,59	0,25

Zawartość glukozy w próbce = γ_glu (z wykresu) · 10
10: rozcieńczenie

A = absorbancja obliczona z transmitancji T: A = - log T

Opracowanie: Alma Kapun Dolinar and Irena Štrumbelj Drusany, Boštjan Ozimek, Biotehniški izobraževalni center Ljubljana