Wykorzystanie pomiaru transmitanji do monitorowania szybkości wzrostu glonów

Celem doświadczenia jest monitorowanie wzrostu glonów Chlorella w skali laboratoryjnej. Wybrane glony mogą mieć potencjalne zastosowanie jako wysokobiałkowy dodatek do żywności i paszy, lub jako nawóz.

Jednokomórkowe glony Chlorella należą do gromady zielenic (Chlorophyta). Są organizmami samożywnymi, wykorzystującymi nieorganiczne formy węgla (np. dwutlenek węgla) do syntezy złożonych związków organicznych.

Bioreaktory służące do hodowli mikroorganizmów powinny być tak zaprojektowane, aby ich wzrost mikroorganizmów następował w optymalnych warunkach. W przypadku hodowli glonów, oznacza to dobry dostęp do światła i dwutlenku węgla. Ważne jest również zapewnienie odpowiedniego mieszania i homogenizacji zawartości bioreaktora.

W czasie trwania procesu biotechnologicznego liczba komórek glonów wzrasta. Wzrost ten można monitorować poprzez pomiar transmitancji próbek (intensywności światła przechodzącego przez próbkę). W tym celu próbki, składające się z komórek glonów zawieszonych w płynnej pożywce, należy pobierać w określonych odstępach czasu.

Ponieważ komórki Chlorella zawierają chlorofil, przyjmują barwę zieloną. Wzrost glonów powoduje wzrost intensywności zielonego zabarwienia próbki. Również same komórki absorbują pewną ilość światła, co wpływa na intensywność światła przechodzącego przez próbkę.

Ilość (objętość) płynnej pożywki pozostaje niezmienna w czasie procesu biotechnologicznego, rośnie natomiast liczba komórek glonów. Z tego powodu rośnie również mętność (nieprzeźroczystość) próbki. To powoduje spadek mierzonych wartości transmitancji. Do pomiarów transmitancji wykorzystuje się diodę emitującą czerwone światło, gdyż ten rodzaj światła jest w najwyższym stopniu pochłaniany przez zielony chlorofil.

Transmitancja jest funkcją liczby komórek glonów zawartych w próbce

Hypoteza

Wzrost liczby komórek glonów powinien powodować stopniowy wzrost mętności próbek pobieranych z bioreaktora w celu monitorowania przebiegu procesu. Wzrost mętności powinien z kolei powodować spadek transmitancji. Stąd przypuszczenie, że pomiar transmitancji może służyć do monitorowania procesu biotechnologicznego.

Aby zweryfikować tę hipotezę, przygotujemy szereg próbek zawiesiny glonów w pożywce, zawierających różną liczbę komórek i zmierzymy ich transmitancję. Wyniki zamieścimy w tabeli. Analiza wyników pozwoli nam stwierdzić, czy wartości transmitancji są jednoznacznie związane z liczbą komórek w próbce.

Przygotowanie próbek do pomiarów transmitancji

Próbki należy pobierać z bioreaktora za pomocą wysterylizowanego sprzętu. Przygotuj pięć oznakowanych wysterylizowanych probówek oraz 50 cm³ sterylnej pożywki (takiej samej jak w bioreaktorze), która będzie służyć do rozcieńczania próbek. Czystość i sterylność sprzętu jest bardzo ważna, gdyż obecność komórek i ich fragmentów może wpłynąć na wynik pomiaru transmitancji.

Przenieś 10 cm³ próbki z bioreaktora sterylną pipetą do pierwszej probówki. Za pomocą kolejnej pipety przenieś 1 cm³ próbki do drugiej probówki i uzupełnij jej zawartość 9 cm³ sterylnej pożywki. Dobrze wymieszaj. Ta próbka jest rozcieńczona 10 (10¹) razy. Ponownie przenieś 1 cm³ roztworu z drugiej probówki do trzeciej probówki i dodaj 9 cm³ pożywki. W ten sposób otrzymasz próbkę rozcieńczoną 100 (10²) razy. Powtórz tę procedurę aby otrzymać kolejne rozcieńczenia:

• próbka początkowa
• próbka rozcieńczona 10 razy
• próbka rozcieńczona 10² razy
• próbka rozcieńczona 10³ razy
• próbka rozcieńczona 10⁴ razy

Przed każdym pobraniem próbki pipetą, zawartość probówki należy energicznie wstrząsnąć.

Pomiar transmitancji

Napełnij zagłębienia blistra dobrze wymieszanymi próbkami (pięć zagłębień). W szóstym zagłębieniu umieść sterylną pożywkę. Przy napełnianiu zagłębień korzystaj z następujących wskazówek:

Wstaw napełniony blister do wytrząsarki, aby zapobiec gromadzeniu się komórek na dnie zagłębienia. Ustaw wytrząsarkę na 320 obr min^-1. Blister powinien pozostawać na wytrząsarce do momentu pomiaru w spektrometrze.

Uruchom spektrometr i włącz diodę emitującą czerwone światło. Wstaw blister do spektrometru. Ustaw wartość transmitancji 100,0 dla sterylnej pożywki (próbka odniesienia). Zmierz wartości transmitancji próbek. Jeżeli pomiar trwa długo, wstaw ponownie blister do wytrząsarki, gdyż komórki gromadzące się na dnie zagłębienia mogą wpłynąć na wyniki pomiaru.

Zliczanie komórek w próbkach

Liczbę komórek w 1 cm³ próbki można zmierzyć za pomocą hemocytometru i mikroskopu. Hemocytometr wykorzystuje się do zliczenia komórek w niewielkiej objętości próbki. Zawartość komórek w 1 cm³ próbki otrzymuje się poprzez przeliczenie wyniku pomiaru. Aby wynik był dokładny, próbka nie może być ani zbyt wielka ani zbyt mała. Jeżeli liczba komórek jest zbyt wielka do policzenia, próbkę należy odpowiednio rozcieńczyć przed zliczaniem. Do obliczenia liczby komórek w 1 cm³ próbki wykorzystuje się następujące równanie:

liczba komórek/1 cm³ = średnia liczba komórek · 4 · 10⁶ · R

Średnią liczbę komórek wyznacza się dzieląc liczbę komórek we wszystkich kwadratach hemocytometru przez liczbę kwadratów. R jest współczynnikiem rozcieńczenia (1 dla próbki nierozcieńczonej, 10¹, 10², itd. dla kolejnych rozcieńczeń próbki).

Weryfikacja hipotezy

W poniższej tabeli podano wyniki pomiarów transmitancji i zliczania komórek. Te dane można wykorzystać do weryfikacji hipotezy, czy liczba komórek wpływa na wartość transmitancji.

Przykład

Tabela 1: Transmitancja próbek o określonej zawartości komórek.

Transmitancja T jest związana z absorbancją A następującym równaniem:

A = –log T

Weryfikacja: Mierzone wartości transmitancji maleją, a obliczone wartości absorbancji rosną ze wzrostem liczby komórek w 1 cm³ próbki.

Wniosek

Przeprowadzone doświadczenie wskazuje na fakt, że zawartość komórek w próbce wpływa na mierzoną wartość transmitancji. Transmitancja rośnie, a absorbancja maleje wraz ze wzrostem liczby komórek. Pomiar transmitancji może być wykorzystany do monitorowania wzrostu liczby glonów w czasie procesu biotechnologicznego.

Opracowanie: Alma Kapun Dolinar