Wyznaczanie liczby komórek za pomocą pomiaru transmitancji

Rozwój drożdży (Saccharomyces cerevisiae) powoduje wzrost liczby komórek w płynnej pożywce, co z kolei skutkuje wzrostem mętności (nieprzeźroczystości) próbki. To z kolei obniża intensywność światła przechodzącego przez próbkę i tym samym również mierzoną transmitancję próbki. W rezultacie obserwowana transmitancja jest funkcją liczby komórek w jednostce objętości próbki.

Aby pomiar transmitancji można było wykorzystać do wyznaczenia liczby komórek, próbkę należy wpierw utrwalić. Należy również wyznaczyć krzywą kalibracyjną.

Komórki drożdży w próbce wciąż się mnożą, dlatego ich liczba stopniowo rośnie. Dlatego przed pomiarem transmitancji należy próbkę utrwalić, to znaczy zatrzymać namnażanie się drożdży. W tym celu próbkę ogrzewa się w 80°C przez 3 minuty: komórki przestają się dzielić lecz nie ulegają zniszczeniu. Liczba komórek w utrwalonej próbce nie zmienia się, taka próbka nadaje się więc do analizy.

Krzywa kalibracyjna przedstawia zależność pomiędzy liczbą komórek a transmitancją. Liczba komórek zawartych w 1 cm³ próbki jest olbrzymia (ok. 2·10¹⁰). Dlatego na krzywej kalibracyjnej liczbę komórek przedstawia się w skali logarytmicznej, podając logarytm naturalny tej liczby. Aby wyznaczyć krzywą kalibracyjną, liczbę komórek zawartych w 1 cm³ próbki wyznacza się za pomocą hemocytometru i mikroskopu.

Krzywa kalibracyjna

Przygotowanie próbki początkowej

1. świeże drożdże piekarnicze
   
   Zmieszaj 1 g świeżych drożdży piekarniczych z 100 cm³ sterylnego roztworu chlorku sodu (0,9 % NaCl). Mieszaj do całkowitej homogenizacji próbki. Następnie ogrzej mieszaninę do 80°C i utrzymuj w tej temperaturze przez 3 minuty z ciągłym mieszaniem, aby otrzymać próbkę początkową.
2. suszone drożdże piekarnicze
   
   Przygotuj roztwór 2 g glukozy (C₆H₁₂O₆) w 200 cm³ sterylnej wody destylowanej i ogrzej go do 30°C. Dodaj 14 g suszonych drożdży piekarniczych i odstaw mieszaninę na pewien czas, żeby drożdże uległy rewitalizacji, co poznasz po wydzielaniu się pęcherzyków dwutlenku węgla. Wówczas ogrzej mieszaninę do 80°C i utrzymuj w tej temperaturze przez 3 minuty, aby otrzymać próbkę początkową.

Przygotowanie próbek rozcieńczonych

Przygotuj pięć oznakowanych wysterylizowanych probówek. Przenieś 10 cm³ próbki początkowej czystą, sterylną pipetą do pierwszej probówki. Pamiętaj o dobrym wymieszaniu próbki przed każdym pobraniem płynu do rozcieńczania. Za pomocą kolejnej pipety przenieś 1 cm³ próbki do drugiej probówki i uzupełnij jej zawartość 9 cm³ sterylnej pożywki (0,9 % NaCl lub roztwór glukozy). Dobrze wymieszaj. Ta próbka jest rozcieńczona 10 (10¹) razy. Ponownie przenieś 1 cm³ roztworu z drugiej probówki do trzeciej probówki i dodaj 9 cm³ pożywki. W ten sposób otrzymasz próbkę rozcieńczoną 100 (10²) razy. Powtórz tę procedurę aby otrzymać kolejne rozcieńczenia:

• próbka początkowa
• próbka rozcieńczona 10 razy
• próbka rozcieńczona 10² razy
• próbka rozcieńczona 10³ razy
• próbka rozcieńczona 10⁴ razy

Przed każdym pobraniem próbki pipetą, zawartość probówki należy energicznie wstrząsnąć.

Do rozcieńczeń zawsze używaj roztworu, który stanowi fazę ciekłą danej próbki.

Zliczanie komórek w próbkach

Liczbę komórek w 1 cm³ próbki można zmierzyć za pomocą hemocytometru i mikroskopu. Hemocytometr wykorzystuje się do zliczenia komórek w niewielkiej objętości próbki. Zawartość komórek w 1 cm³ próbki otrzymuje się poprzez przeliczenie wyniku pomiaru. Aby wynik był dokładny, próbka nie może być ani zbyt wielka ani zbyt mała. Jeżeli liczba komórek jest zbyt wielka do policzenia, próbkę należy odpowiednio rozcieńczyć przed zliczaniem. Do obliczenia liczby komórek w 1 cm³ próbki wykorzystuje się następujące równanie:

liczba komórek/1 cm³ = średnia liczba komórek · 4 · 10⁶ · R

Średnią liczbę komórek wyznacza się dzieląc liczbę komórek we wszystkich kwadratach hemocytometru przez liczbę kwadratów. R jest współczynnikiem rozcieńczenia (1 dla próbki nierozcieńczonej, 10¹, 10², itd. dla kolejnych rozcieńczeń próbki).

Wystarczy, że wyznaczymy liczbę komórek tylko w jednej z rozcieńczonych próbek, ponieważ współczynnik R pozwala obliczyć liczbę komórek we wszystkich pozostałych próbkach, również w próbce początkowej. Każda kolejna próbka jest 10 razy bardziej rozcieńczona niż poprzednia.

Krzywa kalibracyjna przedstawia zależność pomiędzy liczbą komórek a transmitancją. Liczba komórek zawartych w 1 cm³ próbki jest olbrzymia. Dlatego na krzywej kalibracyjnej liczbę komórek przedstawia się w skali logarytmicznej, podając logarytm naturalny tej liczby.

Pomiar transmitancji

Napełnij zagłębienia blistra dobrze wymieszanymi próbkami (pięć zagłębień). W szóstym zagłębieniu umieść sterylną pożywkę. Przy napełnianiu zagłębień korzystaj z następujących wskazówek:

Wstaw napełniony blister do wytrząsarki, aby zapobiec gromadzeniu się komórek na dnie zagłębienia. Ustaw wytrząsarkę na 320 obr min^-1. Blister powinien pozostawać na wytrząsarce do momentu pomiaru w spektrometrze.

Uruchom spektrometr i włącz diodę emitującą niebieskie światło. Wstaw blister do spektrometru. Ustaw wartość transmitancji 100,0 dla sterylnej pożywki (próbka odniesienia). Zmierz wartości transmitancji próbek. Jeżeli pomiar trwa długo, wstaw ponownie blister do wytrząsarki, gdyż komórki gromadzące się na dnie zagłębienia mogą wpłynąć na wyniki pomiaru.

Wpisz zmierzone i obliczone wartości do poniższej tabeli:

Użyj otrzymanych danych do sporządzenia krzywej kalibracyjnej przedstawiającej zależność transmitancji od liczby komórek.

Wyznaczenie nieznanej liczby komórek w próbce za pomocą pomiaru transmitancji

Ogrzej próbkę o nieznanej liczbie komórek przez 3 minuty w temperaturze 80°C, aby zatrzymać namnażanie się komórek. Zmierz transmitancję utrwalonej próbki. Jeżeli zmierzona wartość transmitancji jest niższa niż najmniejsza jej wartość na krzywej kalibracyjnej, próbkę należy rozcieńczyć 10 lub 100 razy. Jeżeli zmierzona wartość jest wyższa niż największa jej wartość na krzywej kalibracyjnej, należy wyznaczyć nową krzywą kalibracyjną używając mniejszej ilości drożdży piekarniczych.

Krzywa kalibracyjna przedstawia zależność transmitancji (y) od liczby komórek (x). Zaznacz na krzywej zmierzoną wartość transmitancji i odczytaj odpowiadającą jej wartość logarytmu naturalnego z liczby komórek w 1 cm³, a następnie wyznacz liczbę komórek.

Jeżeli przed pomiarem transmitancji próbka była rozcieńczona, trzeba to uwzględnić w obliczeniach.

Pożywka użyta do sporządzania próbek może wykazywać własną mętność lub zabarwienie, np. gdy jako pożywki użyje się soku owocowego. W takim przypadku rozcieńczeń należy dokonywać przy pomocy tej samej pożywki. Należy jej również użyć jako próbki odniesienia podczas pomiaru transmitancji.

Przykłady : Wyznaczenie liczby komórek (Saccharomyces cerevisiae) poprzez pomiar transmitancji

Przykład 1:

Tabela 1: Wyniki pomiarów.

Analiza wyników w tabeli pozwala stwierdzić, że wraz ze zmniejszeniem liczby komórek transmitancja rośnie a absorbancja maleje. Transmitancja T jest związana z absorbancją A następującym równaniem:

A = –log T

Wykres 1: Zależność transmitancji od ln (komórki/cm³)

Wykres 2: Zależność absorbancji od ln (komórki/cm³)

Przykład 2:

Tabela 2: Wyniki pomiarów.

Analiza wyników w tabeli pozwala stwierdzić, że wraz ze zmniejszeniem liczby komórek transmitancja rośnie a absorbancja maleje. Transmitancja T jest związana z absorbancją A następującym równaniem:

A = –log T

Wykres 3: Zależność transmitancji od ln (komórki/cm³)

Wykres 4: Zależność absorbancji od ln (komórki/cm³)

Opracowanie: Alma Kapun Dolinar