Opracowywanie nowych zastosowań spektrometru Spektra^TM

W rozdziale tym zawarte są wskazówki dla tych użytkowników spektrometru Spektra^TM, którzy zamierzają opracować swoje własne, nowe zastosowania. Poniżej wskazujemy na zasadnicze różnice pomiędzy budową i działaniem typowych spektrometrów ogólnego użytku, a spektrometru Spektra^TM oraz podajemy wskazówki, które mogą być pomocne przy opracowywaniu nowych zastosowań.

Spektrometr Spektra^TM nie jest uproszoną wersją typowego spektrometu. Różni się od niego nie tylko budową i działaniem, ale również celem, dla którego został opracowany. Typowe spektrometry są skonstruowane w taki sposób, aby zapewniały możliwie wysoką dokładność i precyzję pomiaru absorbancji. Wybór długości fali musi być bardzo dokładny, zapewniając wysoki stopień monochromatyczności światła. W rezultacie, konstrukcja takiego spektrometru jest bardzo złożona i nie zawsze zrozumiała na pierwszy rzut oka dla przeciętnego użytkownika. Zakup takiego spektrometru wiąże się ze sporym wydatkiem.

Spektrometr Spektra^TM został opracowany w innym celu. Naszym zamierzeniem było skonstruowanie niedrogiego, przenośnego i odpornego na uszkodzenia instrumentu o uproszczonej i łatwo zrozumiałej konstrukcji i działaniu, który umożliwiałby pracę z niewielkimi ilościami odczynników chemicznych i stosowanie prostych procedur doświadczalnych. Spektrometr Spektra^TM jest instrumentem o charakterze prototypowym, przeznaczonym przede wszystkim do wykorzystania w edukacji, chociaż okazał się całkiem użyteczny w niektórych ilościowych i półilościowych oznaczeniach zawartości składników w próbkach rzeczywistych.

Nie każdy pomiar wykonywany przy pomocy typowego spektrometru da się zaadaptować do Spektra^TM, a te, dla których jest to możliwe, wymagają poważnych modyfikacji, aby uzyskane wyniki były zadowalające. Przy modyfikacji należy wziąć pod uwagę co najmniej trzy istotne aspekty:

1. Odniesienie kształtu widma absorpcyjnego barwnego produktu w roztworze do widma emisyjnego źródła światła.
2. Sposób obchodzenia się z roztworami
3. Opcjonalnie – modyfikacja lub optymizacja procedury w celu zwiększenia czułości metody.
   

Odniesienie kształtu widma absorpcyjnego barwnego produktu w roztworze do widma emisyjnego źródła światła

W pierwszej kolejności należy rozważyć, czy spektrometr Spektra^TM w ogóle nadaje się do projektowanego zastosowania. Spektra^TM jest wyposażony w trzy diody elektroluminescencyjne, które emitują światło niebieskie, zielone i czerwone o nominalnych długościach fali odpowiednio 430 nm, 565 nm i 625 nm (proszę kliknąć odpowiednie hiperłącze, aby zapoznać się z kształtem widm emisyjnych poszczególnych diod).

Przy pomocy spektrometru Spektra^TM możemy badać tylko te substancje, które efektywnie absorbują światło emitowane przez jedną z trzech diod. Innymi słowy, widmo absorpcyjne badanej substancji musi się w znacznym stopniu pokrywać z widmem emisyjnym wybranego źródła światła. Z tego względu położenia maksimum absorpcyjnego barwnej substancji oraz maksimum emisji wybranej diody powinny być zbliżone. Najkorzystniejsze do pomiarów są szerokie, spłaszczone pasma absorpcyjne. Taką sytuację ilustruje poniższy przykład.

Przykład: Zamierzaliśmy zbadać przydatność spektrometru Spektra^TM do oznaczenia zawartości zielonego barwnika w środku aromatyzującym "Mint" (Tovarna arom in eteričnih olj, d.d., Slovenia). Widmo absorpcyjne tego środka zarejestrowano za pomocą tradycyjnego spektrometru (Rys. 1). Porównanie widma absorpcyjnego z widmami emisyjnymi trzech diod wskazuje, że w tym przypadku odpowiednim źródłem światła będzie dioda emitująca czerwone światło.

Rysunek 1. Widmo absorpcyjne roztworu środka aromatyzującego "Mint" (0,16%vol.) w roztworze octanu amonu (20 mmol dm-3).

W dalszej kolejności przygotowano serię 11 roztworów środka aromatyzującego w roztworze zawierającym 20 mmol dm-3 octanu amonu. Stężenie środka aromatyzującego zmieniało się w granicach 0,05 – 5% vol. Do zagłębień w blistrze wkroplono po 450 ml każdego z roztworów, po czym zmierzono ich transmitancję za pomocą spektrometru Spektra^TM używając diody emitującej czerwone światło i stosując roztwór octanu amonu jako roztwór odniesienia. Wartości transmitancji przeliczono na absorbancję i sporządzono wykres przedstawiający zależność absorbancji od stężenia środka aromatyzującego. Zależność miała charakter liniowy w badanym zakresie stężeń (Rys. 2) ze współczynnikiem korelacji liniowej 0,9992. Przeprowadzone doświadczenie wykazało, że zawartość zielonego barwnika w środku aromatyzującym "Mięta naturalna" może być oznaczana w sposób ilościowy przy pomocy spektrometru Spektra^TM, jeżeli użyjemy diody emitującej czerwone światło jako źródło światła.

Rysunek 2. Krzywa kalibracyjna dla środka aromatyzującego "Mint"

Sposób obchodzenia się z roztworami

Ze względu na specyficzną, pionową geometrię optyczną komory pomiarowej w spektrometrze Spektra^TM (Rys. 3), grubość warstwy cieczy w zagłębieniu blistra określa długość drogi światła przez badany roztwór. Dlatego niezwykle ważne jest zapewnienie identycznych objętości roztworów w zagłębieniach blistra w obrębie tego samego eksperymentu. 

Rysunek 3. Geometria optyczna komory pomiarowej w spektrometrze Spektra^TM

Ważnym zagadnieniem jest przygotowywanie roztworów i ich odmierzanie. Nowi użytkownicy spektrometru Spektra^TM zazwyczaj przygotowują roztwory w sposób tradycyjny, używając kolbek miarowych i przenoszą je do blistra za pomocą mikropipet.

Bardziej pożądanym sposobem, mieszczącym się w koncepcji "zielonej chemii", jest przygotowywanie roztworów bezpośrednio w zagłębieniach blistra. W ten sposób ogranicza się zużycie odczynników i wytwarza się mniej odpadów. Należy jednak uważać, aby suma objętości wszystkich roztworów dodanych z mikropipety do blistra była jednakowa dla każdego zagłębienia, zakładając addytywność objętości. To podejście zmniejsza liczbę operacji podczas przygotowywania roztworów i przyspiesza całą procedurę. Z drugiej jednak strony, przygotowywanie roztworów bezpośrednio w blistrze może utrudniać właściwe wymieszanie składników. W większości przypadków delikatne przesuwanie napełnionego blistra po powierzchni stołu przez kilka – kilkanaście sekund zapewnia odpowiednią homogenizację składników ze względu na niewielką objętość cieczy i wklęsły kształt zagłębienia.

Innym sposobem, odpowiednim dla oznaczeń półilościowych oraz dla wprowadzenia nowych pojęć w szkole, jest odmierzanie roztworów za pomocą kropli. W tym podejściu wykorzystuje się buteleczki z miękkiego tworzywa sztucznego o pojemności 10 cm³, zaopatrzone w odpowiedni wkraplacz. Za jednostkę objętości przyjmuje się jedną kroplę, liczba kropli dodanych do każdego zagłębienia w blistrze musi być jednakowa w ramach jednego eksperymentu. Najważniejszym ograniczeniami tej metody jest niepewna powtarzalność objętości poszczególnych kropli i wpływ lepkości oraz napięcia powierzchniowego na wielkość kropli.

Powtarzalność wielkości kropli bardzo zależy od sposobu postępowania. Wszystkie buteleczki muszą być tego samego rodzaju, stosowanie zakraplaczy medycznych nie sprawdza się w tym przypadku. Ponieważ stopień napełnienia buteleczki ma wpływ na wielkość kropli, powinny być one napełnione najlepiej do trzech czwartych swojej objętości. Właściwy sposób postępowania przedstawiono na Rys. 4.

Rysunek 4. Odmierzanie kropli do zagłębienia w blistrze za pomocą buteleczki z wkraplaczem

Zaleca się, aby pierwszą kroplę odrzucić (np. do zlewki), w ten sposób można sprawdzić, czy krople tworzą się we właściwy sposób, bez zawartych w nich pęcherzyków powietrza. Podczas odmierzania, buteleczkę należy trzymać w pozycji pionowej. Nie należy dopuścić do tego, aby tworząca się kropla dotknęła powierzchni cieczy w zagłębieniu blistra, gdyż to spowoduje odmierzenie mniejszej objętości. Kropla powinna samorzutnie oderwać się od końcówki zakraplacza, zaleca się więc podtrzymywać rękę, aby uniknąć jej drżenia. Powtarzalność tworzenia kropli sprawdzono za pomocą ważenia odmierzonych objętości roztworu. Eksperyment dowiódł, że powtarzalność ze względnym odchyleniem standardowym (RSD) 8% jest osiągana bez większych problemów, natomiast osoby z większym doświadczeniem mogą osiągnąć RSD 3%, stosując pewne określone typy buteleczek

Chociaż wyniki analiz przeprowadzanych na podstawie pomiaru ilości kropel roztworu mogą budzić rezerwę, tym niemniej w doświadczeniach uzyskiwano krzywe kalibracyjne o współczynniku korelacji liniowej dochodzącym do 0,99, a powtarzalność procedur była z reguły wyższa niż się zazwyczaj sądzi. Poniższy przykład (Rys. 5) przedstawia dwie krzywe kalibracyjne dla oznaczeń zawartości wapnia w wodzie otrzymane w dwóch kolejnych latach 2001 i 2002 przez dwóch różnych studentów (Mojca Vrtič i Metka Srebotnik), którzy brali udział w optymalizacji procedur analizy wody przy użyciu spektrometru Spektra^TM i stosowali "kroplową" metodę odmierzania roztworów.

Rysunek 5. Powtarzalność krzywej kalibracyjnej dla spektrometrycznego oznaczania wapnia w wodzie za pomocą spektrometru Spektra^TM i zastosowaniu "kroplowej" metody odmierzania roztworów.

Na stronach www Projektu przedstawiono szereg procedur analitycznych, w których roztwory odmierzane są za pomocą kropli. Jeżeli jednak ktoś woli stosować mikropipety, procedury te łatwo zmodyfikować, przyjmując że jedna kropla odpowiada objętości od 36 do 45 ml, w zależności od rodzaju zastosowanej buteleczki z wkraplaczem. Wprowadzając zmiany należy pamiętać, że proporcje reagentów i próbki muszą pozostać takie same oraz że większa grubość warstwy roztworu w zagłębieniu blistra sprzyja wzrostowi czułości metody. Oczywiście należy unikać nadmiernego napełniania zagłębień, aby uniknąć kontaktu diody z roztworem i zapobiec rozlewaniu się zawartości podczas pomiaru.

Modyfikacja i optymalizacja procedury w celu zwiększenia jej czułości.

Po dostosowaniu procedury analitycznej do specyfiki spektrometru Spektra^TM, często okazuje się, że wielkości mierzonych aborbancji są znacznie niższe niż w przypadku użycia typowego spektrometru. Może to wynikać z dwóch przyczyn. Po pierwsze, droga światła przez próbkę w spektrometrze Spektra^TM (ok. 0,3 cm) jest krótsza niż w spektrometrze tradycyjnym (kiuweta 1 cm). Po drugie, światło emitowane przez diody elektroluminescencyjne jest w znacznie mniejszym stopniu monochromatyczne niż światło z monochromatora tradycyjnego spektrometru.

Zbyt niskie wartości absorbancji mierzone przy pomocy Spektra^TM wymagają zmian w procedurze analitycznej. Do oczywistych modyfikacji należą: zwiększenie stężenia absorbującej substancji, zmniejszenie rozcieńczenia próbki, optymalizacja proporcji pomiędzy reagentami a próbką, zwiększenie objętości próbki w zagłębieniu blistra do akceptowalnego maksimum. W ten sposób można osiągnąć istotną poprawę czułości metody, która przekłada się na bardziej stromy przebieg krzywej kalibracyjnej. Poprawa czułości metody może stanowić również zadanie dla uczniów/studentów w ramach wykonywania projektu, zwiększając w ten sposób zrozumienie zagadnień związanych ze spektrofotometrycznym oznaczaniem stężenia substancji.

Autor: Nataša Gros, Uniwersytet w Lublanie, Wydział Chemii i Technologii Chemicznej.