Oznaczenie zawartności białek w osoczu krwi przy pomocy spektrometru Spektra^TM

WPROWADZENIE

Osocze zawiera znaczne stężenie białek, które pełnią różnorodne funkcje biologiczne. Białka nie posiadają jednoznacznie określonej masy cząsteczkowej, gdyż stanowią mieszaninę różnych albumin i globulin. Dlatego ich stężenie podaje się w g dm^-3 zamiast w mmol dm^-3.

PODSTAWY OZNACZENIA

Białka w osoczu oznacza się przy stosując reakcję biuretową. Nazwa "biuretowa" pochodzi od biuretu, produktu kondensacji dwóch cząsteczek mocznika, zachodzącej w temperaturze powyżej 180 °C. Biuret reaguje z jonami miedzi(II) w środowisku zasadowym dając związek kompleksowy o barwie fioletowej. Również białka i peptydy, posiadające co najmniej dwa wiązania peptydowe (-CONH-), ulegają tej reakcji. Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalne do stężenia białek.

mocznik i biuret

Zakres stosowalności metody: stężenie białek w osoczu 65–80 g dm^-3.

SPRZĘT I ODCZYNNIKI

pipety,
zlewki,
probówki,
pisak wodoodporny,
próbka osocza,
wołowe osocze kontrolne dla biochemii medycznej (dystrybutor Sanolabor , producentRandox),
roztwór wzorcowy białka,
odczynnik do reakcji biuretowej (nierozcieńczony)

Odczynnik do reakcji biuretowej (nierozcieńczony):

4,5 g winianu sodu potasu
40 ml 0,2 M NaOH
1,5 g CuSO₄ · 5 H₂O
0,2 M NaOH do 100 ml

Roztwór do rozcieńczania:

5 g KI
0,2 M NaOH do 1000 ml

Roboczy odczynnik do reakcji biuretowej (rozcieńczony):

1 część nierozcieńczonego odczynnika do reakcji biuretowej i 4 części roztworu do rozcieńczania (1 : 5 lub 1 + 4).

ZAGROŻENIA

	NaOH: wywołuje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, może działać korodująco na metale R: 35 S: 26, 36/37/39, 45
	CuSO₄ · 5 H₂O: szkodliwy w razie spożycia, powoduje poważne podrażnienia oczu, powoduje podrażnienia skóry, bardzo toksyczny dla organizmów wodnych z długo utrzymującym się negatywnym skutkiem R: 22, 36/38, 50/53 S: 22, 60, 61

SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Przygotuj roztwory w oznaczonych probówkach zgodnie ze wskazówkami w tabeli.

Odczynnik	Próbka odniesienia (B)	Roztwór wzorcowy (St)	Próbka (S)
roboczy odczynnik do reakcji biuretowej	400 µL	400 µL	400 µL
wzorcowy roztwór białek	-	10 µL	-
próbka (osocze)	-	-	10 µL
woda dejonizowana	10 µL	-	-

Wymieszaj zawartość probówek i pozostaw na 30 min. w temperaturze pokojowej do zakończenia reakcji. Ustaw wartość transmitancji 100,0 dla próbki odniesienia, następnie zmierz transmitancję roztworów kalibracyjnych i próbki. Zastosuj diodę emitującą światło zielone (546 nm). Następnie oblicz wartości absorbancji.

Równanie do obliczenia stężenia próbki: C_s = A_s ·	C_st
	A_st

C_s - stężenie próbki
A_s - absorbancja próbki
C_st - stężenie roztworu wzorcowego
A_st - absorbancja roztworu wzorcowego

DANE, ZMIERZONE WARTOŚCI, OBLICZENIA

C_st = _____________

T_st (zmierzona)= _____________ A_st (obliczona)= _____________

T_s (zmierzona)= _____________ A_s (obliczona)= _____________

Obliczenie stężenia białek: _____________

Wynik: C_s = _____________

Wartość podawana przez producenta: _____________

Błąd % = _____________

Opracowanie: Sabina Povhe Lenart, Srednja šola za farmacijo, kozmetiko in zdravstvo, Ljubljana