Układ przepływowy do badania reakcji chemiluminescencyjnej

Wprowadzenie

Reakcja luminolu z nadtlenkiem wodoru, katalizowana przez jony metali, jest przykładem reakcji chemiluminescencyjnej. W tego typu reakcjach następuje uwolnienie energii w postaci promieniowania świetlnego. Moc promieniowania jest wprost proporcjonalna do stężenia nadtlenku wodoru, co można wykorzystać do oznaczania stężenia nadtlenku wodoru lub substancji generujących nadtlenek wodoru. Przykładem takiej reakcji jest rozkład glukozy katalizowany oksydazą glukozy. Reakcję tę można wykorzystać w oznaczaniu stężenia glukozy we krwi lub moczu, co jest ważne w rozpoznaniu i leczeniu cukrzycy, groźnej choroby na którą zapada coraz więcej ludzi.

Zadanie

Celem ćwiczenia jest zmontowanie układu przepływowego dla reakcji chemiluminescencyjnej z udziałem nadtlenku wodoru, której przebieg można śledzić za pomocą spektrometru Spektra^TM oraz wyznaczenie zależności pomiędzy mocą emitowanego światła a stężeniem nadtlenku wodoru.

Sprzęt i odczynniki

spektrometr Spektra^TM,
waga analityczna
kolba miarowa 500 ml
kolba miarowa 250 ml (2x)
kolba miarowa 200 ml
kolba miarowa 100 ml (4x)
bagietka szklana
mikropipety do objętości 0,05 ml – 2 ml
zlewka 250 ml
zlewka 150 ml
zlewka 25 ml (4x)
cylinder miarowy 10 ml
kiuweta przepływowa wykonana z folii Shrinky Dinks Crystal Clear i folii Shrinky Dinks Brown, K & B Innovations, North Lake, USA,
węże silikonowe Clear C-FLEX, średnica zewn. 2,1 mm, średnica wewn. 0,5 mm, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois, USA,
kolba ssawkowa z korkiem gumowym (2x),
węże o różnych wymiarach
rurka szklana z kranem
rurka szklana
rurka szklana w kształcie litery L
pompka wodna
węglan sodu
wodorowęglan sodu
węglan amonu
luminol
chlorek kobaltu(II) heksahydrat
nadtlenek wodoru (w=30 %, ρ=1,1 kg dm^-3)

Bezpieczeństwo

Substancja	Zwroty R i S	Symbol
Węglan sodu	R 36 Drażniący dla oczu. S 22-26 Nie wdychać pyłu. W razie kontaktu z oczami przemyć natychmiast obficie wodą i skontaktować się z lekarzem.
Wodorowęglan sodu	/
Węglan amonu	R 22 Szkodliwy w razie spożycia.
Luminol	R: 36/37/38 Drażniący dla oczu, układu oddechowego i skóry. S: 26-36 W razie kontaktu z oczami przemyć natychmiast obficie wodą i skontaktować się z lekarzem. Używać odpowiedniej odzieży ochronnej.
Chlorek kobaltu(II) heksahydrat	R 49-60-42/43-50/53-68 Wdychanie może wywoływać raka. Może działać szkodliwie na płodność. Może powodować nadmierną wrażliwość w razie wdychania i kontaktu ze skórą. Bardzo toksyczny dla organizmów wodnych, może powodować długotrwałe szkodliwe skutki dla środowiska wodnego. Możliwe zagrożenie skutkami nieodwracalnymi. S 53-22-36/37-45-61 Unikać narażenia – przed użyciem zapoznać się ze specjalną instrukcją. Nie wdychać pyłu. Stosować odpowiednią odzież ochronną i rękawice ochronne. W razie wypadku lub złego samopoczucia, natychmiast zwrócić się do lekarza. Unikać wprowadzania do środowiska. Zapoznać się ze specjalnymi instrukcjami w karcie bezpieczeństwa.
Nadtlenek wodoru	R: 34 Wywołuje oparzenia. S: 45-36/37/39-3-26 W razie wypadku lub złego samopoczucia natychmiast zwrócić się do lekarza (jeżeli to mozliwe pokazać etykietę). Używać odpowiedniej odzieży ochronnej, rękawic i okularów ochronnych. Przechowywać w chłodnym miejscu. W razie kontaktu z oczami przemyć natychmiast obficie wodą i skontaktować się z lekarzem.

Sposób postępowania

Przygotowanie roztworu luminolu

Umieść 125 ml wody dejonizowanej w zlewce 250 ml, dodaj 1g Na₂CO₃, 0,05 g luminolu i wymieszaj, aż wszystko się rozpuści. Następnie dodaj 6 g NaHCO₃, 0,125 g (NH₄)₂CO₃ i 0,025 g CoCl₂·6H₂O. Przenieś roztwór ilościowo do kolby miarowej 250 ml i uzupełnij zawartość wodą dejonizowaną do kreski miarowej.

Przygotowanie roztworów nadtlenku wodoru o różnych stężeniach

Przygotuj roztwory o różnych stężeniach rozcieńczając 30% nadtlenek wodoru
(ρ=1,1 kg dm^-3) zgodnie ze wskazówkami w Tabeli 1.

Tabela1: Przygotowanie roztworów o różnych stężeniach nadtlenku wodoru

c [mmol dm^-3]	V (30% H₂O₂) [ml]	V (kolba miar.) [ml]
0,971	0,05	500
1,94	0,05	250
2,43	0,05	200
4,85	0,05	100
48,5	0,5	100
97,1	1	100
194	2	100

Wykonanie kiuwety przepływowej

Z folii Shrinky Dinks Crystal Clear wytnij dwa fragmenty o kształcie sześciokąta, zgodnie z Rys. 1. Wytnij również sześciokąt o takim samym kształcie z nieprzeźroczystej brązowej folii. W brązowym sześciokącie wytnij kształt litery Y, składający się z dłuższego kanału o szerokości 5 mm i dwóch krótszych o szerokości 2,5 mm (Rys. 1).

Rysunek 1: Sześciokątny fragment wycięty z folii Shrinky Dinks foils z zaznaczonym kanałem wyciętym w nieprzeźroczystej brązowej folii.

Włóż brązowy sześciokąt pomiędzy dwa przeźroczyste. Unieruchom położenie sześciokątów przy pomocy niewielkiej ilości kleju w pobliży wylotów kanału i w rogach. Przyciśnij czymś ciężkim i pozostaw do sklejenia na 15 minut. Połącz folie termicznie w piecu o temperaturze 160 °C. Następuje skurczenie i pogrubienie przedmiotu. Używając wiertła 2,1 mm wywierć z boku otwory do kanałów i podłącz węże silikonowe Clear C-FLEX.

Układ przepływowy do reakcji luminescencyjnych

Umieść kiuwetę przepływową w komorze pomiarowej tak, aby rozwidlenie kanałów wypadało dokładnie naprzeciwko czujnika pomiarowego spektrometru Spektra^TM. Ustal położenie przeźroczystą taśmą klejącą. Wytnij dwa otwory w korku gumowym. Przez jeden przeprowadź rurkę szklaną, przez drugi rurkę szklaną z kranem. Umieść korek w pierwszej kolbie ssawkowej i połącz rurkę szklaną bez kranu do drugiej kolby ssawkowej wężem gumowym. Przez drugi korek gumowy przeprowadź rurkę w kształcie litery L. Połącz rukę szklaną wężem silikonowym z dłuższym kanałem kiuwety przepływowej. Węże wychodzące z pozostałych dwóch kanałów wprowadź do zlewek 25 ml, jednej zawierającej roztwór luminolu i drugie zawierającej roztwór nadtlenku wodoru. Po połączeniu pierwszej kolby ssawkowej z pompką wodną, reagenty zostają zassane do kanałów, mieszają się i reagują przepływając przez dłuższy kanał, co pozwala śledzić reakcję chemiluminescencyjna za pomocą spektrometru Spektra^TM. Podczas pomiarów źródło światła spektrometru nie jest używane, komorę pomiarową należy zabezpieczyć przed otaczającym światłem pudełkiem z czarnego papieru. Elektroniczne wzmocnienie spektrometru Spektra^TM jest ustawione na maksimum, z wszystkimi potencjometrami w skrajnym prawym położeniu. Układ przepływowy przedstawiono na rysunku 2.

Rysunek 2: Układ przepływowy do śledzenia reakcji chemiluminescencyjnej za pomocą spektrometru Spektra^TM.

Pomiar intensywności reakcji chemiluminescencyjnej

Zanurz końce obu rurek wlotowych do dwóch zlewek 25 ml napełnionych wodą dejonizowaną i zacznij zasysać wodę do układu. Użyj kranu do regulacji przepływu, tak aby wynosił on 2,5 ml min^-1 dla każdej zlewki. Regulacja będzie łatwiejsza, jeżeli zamiast zlewek użyjemy cylindra miarowego z wodą dejonizowaną. Przenieś rurki wlotowe do zlewki z roztworem luminolu i do zlewki z najbardziej rozcieńczonym roztworem nadtlenku wodoru, odczytaj wskazania wyświetlacza. Przemyj układ wodą dejonizowaną i dokonaj pomiaru dla kolejnego roztworu nadtlenku wodoru, aż do końca. Zapisz wyniki tak jak to przedstawiono w Tabeli 2.

Wyniki

Wyniki przedstawiono w Tabeli 2 i na Rys. 3.

Tabela 2: Intensywność reakcji chemiluminescencyjnej dla różnych stężeń nadtlenku wodoru.

c [mmol dm^-3]	0,971	1,94	2,43	4,85	48,5	97,1	194
Response	1,1	1,4	1,6	2,5	10,1	13,4	14

Rysunek 3: Zależność natężenia światła od stężenia nadtlenku wodoru.

Dyskusja

Intensywność światła emitowanego wskutek reakcji chemiluminescencyjnej rośnie wraz ze stężeniem nadtlenku wodoru do stężenia ok. 0,1 mol dm^-3. Dla niskich stężeń milimolowych nadtlenku wodoru zależność jest liniowa, co można wykorzystać w oznaczeniach ilościowych. Przedstawiony układ przepływowy umożliwia oznaczanie niskich stężeń nadtlenku wodoru.

Opracowanie: Dr. Nataša Gros, Karmen Lampreht, Uniwersytet w Lublanie, Wydział Chemii i Technologii Chemicznej