Spremljanje alkoholnega vrenja

PRINCIP

Alkoholno vrenje je tip anaerobnega vrenja ali fermentacije. Med vrenjem se glukoza razgradi do etanola in ogljikovega dioksida. Ti dve snovi sta glavna končna produkta alkoholnega vrenja. Poleg etanola in ogljikovega dioksida nastajajo med alkoholnim vrenjem še druge snovi. Od vrste mikroorganizmov, v čigar celicah poteka vrenje, je odvisno, kolikšen je delež glavnih in stranskih produktov.

Proces alkoholnega vrenja je biotehnološki proces, v katerem so biokultura kvasovke, substrat je raztopina, ki vsebuje hranilne snovi. Od koncentracije in vrste sladkorja v substratu je odvisna hitrost vrenja.

Vse biotehnološko pomembnejše kvasovke, ki se uporabljajo za proizvodnjo alkoholnih pijač so iz skupine fakultativno anaerobnih kvasovk. V anaerobnih razmerah razgradijo organske spojine do etanola in vode, v aerobnih razmerah pa so sposobne popolnega dihanja.

Spremljanje bioprocesa

Iz bioreaktorja vzamemo vzorec, ga prefiltriramo in dodamo 3,5-dinitrosalicilno kislino (DNS - reagent).
Pri segrevanju v prisotnosti sladkorjev (glukoze) nastane rdečerjav produkt, 3-amino,5-nitrosalicilna kislina. Intenzivnost razvite barve merimo s spektrometrom Spektra^TM pri prižgani modri LED.

REAGENTI

• raztopina 3,5 - dinitrosalicilne kisline (DNS -reagent)

Zatehtamo 10 g DNS in jo raztopimo v 200 mL 2 M NaOH. Raztopino med stalnim, intenzivnim mešanjem segrevamo. Dodamo barvni stabilizator (raztopina K,NaC₄H₄O₆× 4H₂O - raztopimo 300g K,NaC₄H₄O₆× 4H₂O v 500 mL destilirane vode). Dobro premešamo ti dve raztopini in dopolnimo do 1 L z destilirano vodo.

NEVARNOSTI

3,5 - dinitrosalicilna kislina, Xn R: 20/21/22 S: 24/25

POSTOPEK

Priprava biorekatorja

Pripravimo bioreaktor z anaerobnimi razmerami in prosto biokulturo. Na bioreaktor namestimo vrelno veho.

Priprava substrata

Pripravimo 5 kg raztopine glukoze z masnim deležem 13%.

Priprava biokulture

Pripravimo suspenzijo kvasovk: 4 g kvasa/5 kg. (2×10⁸/ml suspenzije)

Osnovna standardna raztopina glukoze

Natehtamo 1,5 g glukoze, jo kvantitativno prenesemo v 100 mL merilno bučko, dopolnimo do 100 mL in dobro premešamo. γ_(glu) = 15 mg/mL

Priprava vzorca za meritev

Iz bioreaktorja vzamemo 10 mL vzorca in ga prefiltriramo z vakuumsko filtracijo. Odpipetiramo 1 mL filtrata in mu dodamo 9 mL destilirane vode.

Serija kalibracijskih raztopin za pripravo umeritvene krivulje

Pripravimo 5 merilnih bučk z volumnom 100mL in jih označimo. V bučke odpipetiramo 2, 3, 6, 8 in 10 mL (v vsako bučko eno količino) standardne raztopine glukoze. Z destilirano vodo dopolnimo do 100mL in dobro pretresemo. Dobili smo raztopine sladkorja z masnimi koncentracijami 0,3mg/mL, 0,45 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,2 mg/mL in 1,5 mg/mL.

MERITVE

Pripravimo 7 epruvet : :

• v 5 epruvet odpipetiramo po 1 mL raztopin za umeritveno krivuljo (masne koncentracije 0,3 mg/mL, 0,45 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,2 mg/mL in 1,5 mg/mL),
• priprava slepega vzorca: v epruveto odpipetiramo 1 mL destilirane vode
• v zadnjo epruveto odpipetiramo 1 mL pripravljenega vzorca iz bioreaktorja.

V vsako epruveto dodamo:

• po 1 mL DNS reagenta (3,5-dinitrosalicilne kisline),
• po 2 mL destilirane vode.

Epruvete segrevamo v vreli vodni kopeli 5 minut, da poteče reakcija med glukozo in DNS reagentom. Epruvete ohladimo in dodamo do 10 mL destilirane vode in dobro premešamo.

Iz vsake epruvete odpipetiramo v udolbine blistra po 400 µl pripravljene raztopine.

Transmitanco merimo s spektrometrom Spectra^TM. Uporabimo modro LED in pri njeni maksimalni intenziteti nastavimo transmitanco slepega vzorca na 100.

REZULTATI

Tabela 1: Odvisnost absorbance od masne koncentracije (mg/mL)

Graf 1: Kalibracijska premica- odvisnost A od masne koncentracije

Tabela 2: Rezultati štiri tedenskega spremljanja alkoholne fermentacije

g glukoze/100mL vzorca = g glukoze odčitana iz grafa 1 . 10
10 = razredčitev

A = (izračunana iz T), A = -log T

Pripravili: Alma Kapun Dolinar in Irena Štrumbelj Drusany, Boštjan Ozimek, Biotehniški izobraževalni center Ljubljana