Spremljanje rasti biomase z merjenjem transmitance

V laboratorijskem bioreaktorju želimo gojiti mikroalgo Clorella. Alga je uporabna kot beljakovinski dodatek hrani za ljudi in krmi za živali. Uporabljajo pa jo tudi kot gnojilo za rastline.

Alge vrste Clorella so fotoavtotrofne zato mora biti bioreaktor zgrajen tako, da je omogočen dostop svetlobe in CO₂ do celic. S tem omogočimo fotosintezo in rast števila celic.

Konstrukcija bioreaktorja mora biti takšna, da omogoča takšno mešanje suspenzije celic, da je biomasa ves čas poteka bioprocesa čim bolj homogena.

Predvidevamo, da bo število celic med potekom bioprocesa rastlo. Rast števila celic (biomase) bomo spremljali z merjenjem transmitance (količine svetlobe, ki jo prepušča vzorec).

Količina vodne raztopine v kateri rastejo alge se med potekom bioprocesa ne spreminja, povečuje pa se število celic. Z rastjo števila celic se povečuje motnost suspenzije in njena zelena barva postaja intenzivnejša. Zato sklepamo, da se spreminja tudi količina prepuščene svetlobe skozi vzorec suspenzije odvzete iz bioreaktorja. Z rastjo števila celic, bi morala transmitanca padati.

Za merjenje transmitance skozi suspenzijo alg izberemo rdečo svetlobo.

Odvisnost transmitance od števila celic v vzorcu

Hipoteza

Predpostavljamo, da s povečevanjem števila celic alg v suspenziji pada transmitanca.
Torej lahko rast števila celic alge Chlorella spremljamo z merjenjem transmitance.

Pravilnost hipoteze preverimo tako, da pripravimo vzorce suspenzije alg in v njih preštejemo celice ter jim izmerimo transmitanco. Rezultate merjenj vpišemo v preglednico in ocenimo spremembe vrednosti transmitance v odvisnosti od števila celic.

Priprava vzorcev za merjenje

Sterilno odvzamemo vzorec iz bioreaktorja. To je začetni vzorec.

Pripravimo stojalo za epruvete in 5 čistih epruvet in 50 mL sterilnega substrata (raztopine v kateri alge rastejo).

Pomembno je, da raztopina za razredčevanje ne vsebuje nobenih celic ali delcev, ki bi lahko povečali motnost in s tem vplivali na količino prepuščene svetlobe.

V prvo epruveto nalijemo 10 mL dobro premešane začetnega vzorca.

1 mL dobro pretresenega začetnega vzorca dodamo 9 mL destilirane vode in dobimo vzorec z razredčitvijo 10^-1.

1 mL dobro premešanega razredčenega vzorca dodamo 9 mL destilirane vode in dobimo vzorec z razredčitvijo 10^-2. Pred jemanjem susupenzije celic iz epruvete vsebino epruvete dobro premešamo s stresalnikom za epruvete.

Postopek ponovimo še dvakrat, da dobimo razredčitveno vrsto s 5 vzorci: začetni vzorec, razredčitev 10^-1, razredčitev 10^-2, razredčitev 10^-3 in razredčitev 10^-4.

Merjenje transmitance vzorcev

Z dobro premešanimi vzorci napolnimo pet vdolbin blistra. V šesto vdolbino damo raztopino, ki smo jo uporabili za razredčevanje vzorcev.

V vdolbine odmerimo po 250 µL suspenzij in blister damo na stresalnik (320 RPM), da preprečimo usedanje celic na dno vdolbin. Če vdolbine blistra napolnimo z večjo količino suspenzije se med stresanjem na stresalniku suspenzija preliva iz vdolbin.

Pripravimo spektrometer, prižgemo rdečo LED ter svetilnost naravnamo na največjo.

Blister s stresalnika prestavimo v spektrometer, pri raztopini za redčenje kot slepi uravnamo transmitanco na 100,0. Nato izmerimo transmitanco vzorcev. Če traja merjenje predolgo, je treba blister ponovno postaviti na stresalnik, da ostanejo vzorci suspenzij celic homogeni in se ne tvori usedlina.

Določanje števila celic v 1 mL vzorca

Z Burker – Turkovo komoro pod mikroskopom preštejemo celice kvasovk v razredčitvi, ki je števna. Število celic ne sme biti preveliko, ker jih ni mogoče natančno prešteti. Ne sme biti premajhno, ker je napaka pri štetju prevelika.

Število celic v mL vzorca izračunamo:

število celic/ mL suspenzije = povprečno število celic· 4 · 10⁶ · R

Povprečno število celic določimo tako, da preštejemo celice v kvadratkih komore in njihovo vsoto delimo s številom kvadratkov.

R = 1 Razredčitev vzorca upoštevamo kadar želimo izračunati število celic v začetnem vzorcu. Kadar želimo določiti število celic v določenem vzorcu, je vrednost razredčitve 1.

Preverjanje pravilnosti postavljene hipoteze

V preglednico zapišemo dobljene rezultate štetja celic in merjenja transmitance. Ocenimo spremembe vrednosti transmitance v odvisnosti od števila celic.

Glede na vrednosti rezultatov merjenja lahko postavljeno hipotezo potrdimo ali ovržemo.

Primer

Preglednica 1: Rezultati merjenj T v vzorcih z določenim številom celic/mL

Iz vrednosti merjenj v preglednici je videti, da transmitanca z naraščajočim številom celic pada.

Sklep

S poskusnim merjenjem smo ugotovili, da z naraščajočim številom celic pada transmitanca.

Glede na rezultate poskusnega merjenja lahko ugotovimo, da lahko rast biomase (povečevanje števila celic) med potekom bioprocesa spremljamo z merjenjem transmitance s spektrometrom.

Pripravila: Alma Kapun Dolinar