Določanje števila mikroorganizemskih celic v vzorcu
z merjenjem transmitance

Z večanjem števila celic kvasovk (Saccharomyces cerevisiae) v vzorcu se veča motnost vzorca. Z večanjem motnosti pa se manjša delež prepuščene svetlobe skozi vzorec in s tem transmitanca.

Za določanje števila celic kvasovk z merjenjem transmitance je treba stabilizirati vzorec in narediti umeritveno krivuljo.

Vzorec je treba stabilizirati zato, da se v njem število celic ne spreminja več. Vzorec stabiliziramo tako, da ga segrevamo 3 minute pri 80°C. V tem času se celice inaktivirajo, razgradijo pa se še ne.

Umeritveno krivuljo narišemo tako, da prikazuje odvisnost transmitance od logaritma števila celic.

Število celic v vzorcu določimo z direktnim štetjem celic z Burker – Turkovo komoro.

Meritve transmitance in štetje celic
za pripravo umeritvene krivulje

Priprava začetne suspenzije

1. iz svežega pekovskega kvasa
   
   1g svežega pekovskega kvasa dobro razmešamo v 100 mL destilirane vode. Suspenzijo segrejemo na 80°C in jo pri tej temperaturi obdržimo 3 minute. To je začetna suspenzija.
2. iz suhega pekovskega kvasa
   
   200 mL sterilne destilirane vode segrejemo na 30°C in v njej raztopimo 2 g glukoze (C₆H₁₂O₆). V pripravljeno raztopino vmešamo dva zavitka suhega kvasa (14 g). Posodo zapremo in počakamo, da celice oživijo (revitalizacija) in se začne izločati CO₂. Suspenzijo segrejemo na 80°C in jo pri tej temperaturi obdržimo 3 minute. To je začetna suspenzija.

Priprava umeritvenih razredčitev

Iz suspenzije pripravimo umeritvene razredčitve na enak način, kot pripravljamo razredčitveno vrsto.

Pripravimo stojalo za epruvete in 5 čistih epruvet.

V prvo epruveto nalijemo 10 mL dobro premešane začetne suspenzije.

1 mL dobro pretresene začetne suspenzije dodamo 9 mL destilirane vode in dobimo vzorec z razredčitvijo 10^-1.

1 mL dobro premešanega razredčenega vzorca dodamo 9 mL destilirane vode in dobimo vzorec z razredčitvijo 10^-2. Pred jemanjem susupenzije celic iz epruvete vsebino epruvete dobro premešamo s stresalnikom za epruvete.

Postopek ponovimo še dvakrat, da dobimo razredčitveno vrsto s 5 vzorci:

začetni vzorec, razredčitev 10^-1, razredčitev 10^-2, razredčitev 10^-3 in razredčitev 10^-4.

Določanje števila celic v umeritvenih razredčitvah

Z Burker – Turkovo komoro pod mikroskopom preštejemo celice kvasovk v razredčitvi, ki je števna. Število celic ne sme biti preveliko, ker jih ni mogoče natančno prešteti. Ne sme biti premajhno, ker je napaka pri štetju prevelika. Število celic v mL vzorca izračunamo:

število celic/ mL suspenzije = povprečno število celic· 4 · 10⁶ · R

Povprečno število celic določimo tako, da preštejemo celice v kvadratkih komore in njihovo vsoto delimo s številom kvadratkov.

R razredčitev vzorca: če je razredčitev vzorca 10^-2, v formulo vstavimo 10², ker je zaradi stokratne razredčitve prešteto število celic stokrat premajhno.

S tem izračunom dobimo število celic v mL začetnega vzorca.

Ker je vsak naslednji vzorec v razredčitveni vrsti desetkratna razredčitev prejšnjega, predvidevamo, da vsebuje desetkrat manj celic kot prejšnji.

Če poznamo število celic v mL začetne raztopine lahko izračunamo število celic v vseh drugih vzorcih.

Izračunamo logaritme z osnovo 10 števil celic v vseh vzorcih razredčitvene vrste.

Merjenje transmitance vzorcev umeritvenih razredčitev

Z dobro premešanimi vzorci iz razredčitvene vrste napolnimo pet vdolbin blistra. V šesto vdolbino damo destilirano vodo.

V vdolbine odmerimo po 250 µL suspenzij in blister damo na stresalnik (320 RPM), da preprečimo usedanje celic na dno vdolbine. Če vdolbine blistra napolnimo z večjo količino suspenzije se med stresanjem na stresalniku suspenzija preliva iz vdolbin. Blister z vzorci pustimo na stresalniku dokler suspenzije v vdolbinah niso homogene.

Pripravimo spektrometer, prižgemo modro LED ter svetilnost naravnamo na največjo.

Blister s stresalnika prestavimo v spektrometer, pri destilirani vodo kot slepi uravnamo transmitanco na 100,0. Nato izmerimo transmitanco vzorcev. Če traja merjenje predolgo, je treba blister ponovno postaviti na stresalnik, da ostanejo vzorci suspenzij homogeni in se ne tvori usedlina.

V preglednico vnesemo izmerjene in izračunane vrednosti.

Iz podatkov narišemo graf s krivuljo, ki prikazuje odvisnost T od ln štev. celic.

Meritve za določanje števila celic v neznanem vzorcu

Uporaba umeritvene krivulje

Suspenziji kvasovk v destilirani vodi z neznanim številom določimo število celic tako, da vzorec najprej stabiliziramo. Vzorcu nato izmerimo T.

Če je izmerjena T manjša kot najmanjša transmitanca, ki smo jo izmerili za umeritveno krivuljo, vzorec razredčimo (desetkrat, če še ni dovolj stokrat).

Če je transmitanca večja, kot največja transmitanca, ki smo jo izmerili za umeritveno krivuljo, je treba umeritveno krivuljo narediti še enkrat z manjšo količino kvasovk v začetnem vzorcu.

Iz krivulje v grafu odčitamo ln števila celic. Iz odčitane vrednosti izračunamo število celic v mL suspenzije.

Če smo vzorec redčili, razredčitev upoštevamo pri računanju števila celic.

Če je tekoča faza v suspenziji kvasovk vzorca obarvana ali motna (jabolčni sok, grozdni sok, fiziološka raztopina ipd.), je potrebno razredčitveno vrsto narediti z enako tekočo fazo. Prav tako je treba spektrometer umerjati z enako tekočo fazo.

Primer določanja števila celic (Sacharomyces cerevisae) z merjenjem transmitance

1.primer

Preglednica 1: Vpliv števila celic na mL vzorca na izmerjeno transmitanco svetlobe skozi vzorec

Iz vrednosti v preglednici je videti, da z razredčevanjem vzorcev transmitanca narašča, absorbanca pa pada.

A (absorbanca) je vrednost izračunana iz izmerjene transmitance :

A = - log T

Graf 1: Odvisnost transmitance od ln štev. celic/mL

Graf 2: Odvisnost absorbance od ln štev. celic/mL

2.primer

Preglednica 1: Vpliv števila celic na mL vzorca na izmerjeno transmitanco svetlobe skozi vzorec

Iz vrednosti v preglednici je videti, da z razredčevanjem vzorcev transmitanca narašča, absorbanca pa pada.

A (absorbanca) je vrednost izračunana iz izmerjene transmitance :

A = - log T

Graf 3: Odvisnost transmitance od ln štev. celic/mL

Graf 4: Odvisnost absorbance od ln štev. celic/mL

Pripravila: Alma Kapun Dolinar