Razvoj aplikacij za spektrometer Spektra^TM

Cilj tega prispevka je pomagati morebitnemu uporabniku spektrometra Spektra^TM pri razvijanju lastnih aplikacij. V nadaljevanju so opisane razlike med spektrometri splošne namembnosti in spektrometrom Spektra^TM. Podani so tudi napotki, kako začeti razvijati lastne aplikacije, da bi bili pri tem uspešni.

Spektrometer Spektra^TM ni nadomestek za spektrometre splošne namembnosti. Oboji imajo svoj namen in so osredotočeni na različen cilj. Pri spekrometrih splošne namembnosti je temeljni cilj zagotoviti čim večjo pravilnost in ponovljivost meritev absorbance, zaradi česar mora biti izbira valovne dolžine svetlobe čimbolj pravilna in svetloba  čimbolj monokromatska. Zaradi tega je konstrukcija takega spektrometra zapletena, njegova zgradba pa povprečnemu uporabniku ne ravno razvidna.  Nakup takega spektrometra je tudi precejšnja investicija.

Cilj razvoja in izdelave spektrometra Spektra^TM je bil drugačen. Temeljni cilj je bil: nizko-cenovni, prenosni in robustni instrument s poenostavljeno in enostavno razumljivo zgradbo in delovanjem, ki omogoča majhno porabo reagentov in poenostavljen eksperimentalni pristop. Spektrometer Spektra^TM  je empirični instrument, primarno namenjen za izobraževalne namene, še zlasti za izkustveno uvajanje konceptov. Potrjena pa je tudi njegova uporabnost za kvantitativne in semi-kvantitativne določitve različnih parametrov v realnih vzorcih na mestu odvzema.

Prav vsake aplikacije, ki jo izvajamo na spektrometru splošne namembnosti, ni mogoče prenesti na spektrometer  Spektra^TM in pri večini prenosljivih aplikacij bodo za uspešnost potrebne vsaj majhne prilagoditve postopkov. Kje so torej omejitve v prenosljivosti aplikacij in kaj moramo upoštevati? Gre za tri temeljne vidike:

1. Presoja oblike absorpcijskega spektra obarvanega produkta v primerjavi z emisijskimi spektri svetila.
2. Rokovanje s tekočinami.
3. Po izbiri tudi prilagoditev ali optimizacija postopka za izboljšanje njegove občutljivosti.

Presoja oblike absorpcijskega spektra obarvanega produkta v primerjavi z emisijskimi spektri svetila.

Prvo je treba presoditi primernost aplikacije za prenos na spektrometer Spektra^TM. Spektrometer Spektra^TM ima tri sevala modro, zeleno in rdeče z nazivnimi valovnimi dolžinami 430 nm, 565 nm and 625 nm (za opazovanje oblike emisijskih spektrov posameznih seval kliknite na pripadajoče povezave).

Razvoj aplikacije za spektrometer Spektra^TM bo uspešen le, če bo lahko obarvani produkt v raztopini  učinkovito absorbiral svetlobo izbranega svetila. To pa se bo zgodilo samo v primeru, da se absorpcijski spekter obarvanega produkta v preiskovani raztopini učinkovito prekriva z emisijskim spektrom svetila. Zato se valovna dolžina maksimuma absorpcije  obarvanega produkta in valovna dolžina emisijskega maksimuma izbranega svetila ne smeta preveč razlikovati. Poleg tega so zlasti zaželeni absorpcijski spektri s širokimi topimi vrhovi. Kar smo pravkar opisali, ponazarjamo s primerom.  

Primer: Želimo ugotoviti ali je spektrometer Spektra^TM primeren za določanje zelenega barvila v naravni aromi Meta (Tovarna arom in eteričnih olj, d.d., Slovenija). Spekter arome Meta smo posneli s spektrometrom splošne namembnosti (Slika 1). Na osnovi  primerjave absorpcijskega spektra arome Meta in emisijskih spektrov treh seval smo predvideli, da naj bi bilo rdeče sevalo (rdeča LED) primerno za to aplikacijo.

Slika 1. Absorpcijski spekter raztopine naravne arome Meta (0,16 volume %) v raztopini amonijevaga acetata s koncentracijo 20 mmol/L.

Primernost te aplikacije smo nadalje preizkusili tako, da smo pripravili niz 11 raztopin arome Meta v raztopini amonijevega acetata s koncentracijo 20 mmol/L. Koncentracija arome Meta je naraščala od  0,05 do 5 volumskih %. 450 ml vsake od raztopin smo prenesli v vdolbino blistra. S spektrometrom Spektra^TM smo izmerili transmitance pri rdeči LED proti raztopini amonijevega acetata kot slepi. Transmitance smo pretvorili v absorbance, te pa prikazali grafično v odvisnosti od koncentracije raztopine arome Meta. Potrdili smo linearno odvisnost absorbance od koncentracije raztopin arome Meta v koncentracijskem območju od  0,05 do 2 volumskih %, kot kaže Slika 2, in to z visokim korelacijskim koeficientom 0,9992. Poskusi so potrdili, da je zeleno barvilo v aromi Mete mogoče kvantitativno določati s spektrometrom Spektra^TM ob uporabi rdeče LED.

Slika 2. Kalibracijski graf za aromo Meta

Rokovanje s tekočinami

Zaradi specifične - vertikalne optične geometrije merilne celice spektrometra Spektra^TM (Slika 3) je dolžina poti svetlobe skozi preiskovano raztopino določena z ravnjo tekočine v vdolbini blistra. Zato je temeljnega pomena, da so tekočinske ravni v vseh vdolbinah blistra znotraj istega poskusa enake.

Slika 3. Optična geometrija merilne komore spektrometra Spektra^TM.

Ustrezno rokovanje z raztopinami je zelo pomembno, uporabimo pa lahko različne pristope. Način, ki ga najpogosteje uporabljajo novi uporabniki spektrometra Spektra^TM, je, da pripravijo raztopine klasično npr. v merilnih bučkah in nato enake odmerke raztopin prenesejo v vdolbine blistra z mikropipeto.

Drugi koristnejši način uporabe spektrometra Spektra^TM, ki je bolj v skladu z načeli zelene kemije je, da pripravimo preiskovane raztopine neposredno v vdolbinah blistra in posledično porabimo man kemikalij ter proizvedemo manj kemijskih odpadnih raztopin. Paziti pa moramo, da je seštevek vseh dodatkov z mikropipeto v vsako od vdolbin blistra enak, ob predpostavki, da so volumni aditivni. Tak način zmanjša število operacij, ki jih opravimo pri rokovanju z raztopinami, zaradi česar je postopek hitrejši, vendar se lahko pojavi vprašanje ustreznega mešanja. Zaradi majhne prostornine vdolbine blistra in konkavne oblike, homogenost raztopine običajno hitro dosežemo že s kratkotrajnim previdnim premikanjem blistra vzdolž površine laboratorijske mize.

Tretji mogoč način, ki je primeren za semikvantitativne analize ali uvajanje konceptov v šole, je priprava raztopin v vdolbinah blistra z odmerjanjem kapljic. Pri tem načinu uporabljamo deset-mililitrske plastenke s kapalnim nastavkom, kapljico pa pojmujemo kot osnovno prostorninsko enoto. Skupno število dodanih kapljic mora biti enako za vse vdolbine blistra. Uporabnik pa mora pri tem načinu presoditi različne izvore nezanesljivosti. Najpomembnejša sta omejena ponovljivost prostornin kapljic odmerjenih s kapalnimi plastenkami in vpliv razlik v viskoznosti in površinski napetosti raztopin na prostornino odmerjenih kapljic.

Ponovljivost prostornin kapljic je zelo odvisna od eksperimentalne tehnike. Vse kapalne plastenke morajo biti enake, običajne kapalke nikakor niso primerne. Kapalne plastenke ne smejo biti niti prepolne niti preveč prazne, sicer bo to vplivalo na prostornino kapljice. Najbolje je, če je plastenka napolnjena do treh četrtin. Pravilno eksperimentalno tehniko ponazarja Slika 4.

Slika 4. Odmerjanje kapljic v vdolbino blistra s plastenko s kapalnim nastavkom.

Priporočljivo je, da prvo kapljico kanemo v čašo, tako namreč lahko preverimo, če se kapljica oblikuje pravilno, brez zračnega mehurčka. Pri odmerjanju kapljic mora biti plastenka v navpičnem položaju. Ne smemo dopustiti, da bi se kapljica med nastajanjem dotaknila površine tekočine v blistru, sicer bo njena prostornina premajhna. Kapljica se mora sama odtrgati od konice kapalke, zato je priporočljivo, da roko opremo na podlago in tako preprečimo tresenje. Ponovljivost odmerjanja kapljic smo preverili s tehtanjem. Poskus je potrdil, da je enostavno mogoče doseči ponovljivost z relativnim standardnim odklonom (RSD) 8 %, vendar lahko izurjena oseba z nekaterimi izvedbami plastenk s kapalnim nastavkom doseže tudi  bistveno boljši RSD in to kar 3 %.

Mogoče je dvomiti v eksperimentalni pristop osnovan na odmerjanju kapljic, vendar so eksperimenti potrdili, da je mogoče na ta način dobiti kalibracijsko premico s korelacijskim koeficientom, ki dosega vrednost 0,99, pa tudi obnovljivost postopka ni nujno tako slaba, kot bi morda kdo pričakoval. Dva primera kalibracijskih premic za določanje kalcija v vodi, ki sta bili dobljeni z odmerjanjem kapljic, sta prikazana na Sliki 5. Ti dve premici sta dobili študentki kemijskega izobraževanja Mojca Vrtič in Metka Srebotnik, ki sta leta 2001 oz. 2002 v okviru svojih diplomskih del sodelovali pri optimizaciji postopkov za analizo vod s spektrometrom Spektra^TM.  

Slika 5. Obnovljivost kalibracijskih premic za določanje kalcija v vodi, dobljenih s spektrometrom Spektra^TM, in to z eksperimentalnim pristopom osnovanim na odmerjanju kapljic

Pri številnih postopkih, ki so opisani na spletni strani Projekta, je uporabljen eksperimentalni pristop z odmerjanjem kapljic. Če bi raje uporabili mikropipete, je postopke enostavno mogoče prilagoditi tako, da upoštevamo, da je pri večini plastenk s kapalnim nastavkom - odvisno pač od njihove izvedbe - prostornina kapljice med 36 in 45 mL. Najpomembnejše za optimiziran postopek je, da ohranimo razmerje med reagenti in vzorcem nespremenjeno, vsekakor pa je za boljšo občutljivost postopka bolje imeti čim debelejši sloj tekočine v vdolbini blistra. Paziti pa moramo, da vdolbina blistra ni prepolna, da LED ne pride v stik z raztopino in, da po zaprtju pokrova merilne celice spektrometra Spektra^TM, ne pride do razlitja tekočine.

Prilagoditev ali optimizacija postopkov z namenom izboljšanja
njihove občutljivosti

Če smo potrdili prenosljivost aplikacije s spektrometra za splošno uporabo na spektrometer Spektra^TM, lahko naletimo na težavo, da so absorbance bistveno nižje kot pri izvornem postopku. Vzroka za manjšo občutljivost sta dva. Prvi razlog je krajša pot svetlobe skozi preiskovano raztopino, ki je pri spektrometru Spektra^TM približno 0,3 cm in ne 1 cm, kar je običajno pri spektrometrih splošne namembnosti, kjer so take optične celice najpogostejše. Drugi razlog pa je, da je svetloba, ki jo emitira LED veliko manj monokromatska kot svetloba iz monokromatorja pri spektrometrih splošne namembnosti.

Če ugotovimo, da so absorbance dobljene s spektrometrom Spektera^TM prenizke, si lahko pomagamo z nekaterimi prilagoditvami postopka. Pristopi, ki prispevajo k povečanju občutljivosti postopka in se odražajo na strmejši kalibracijski premici, so: znižanje razredčitve vzorca, zvišanje koncentracije barvnega reagenta, optimizacija prostorninskih razmerij med reagenti in vzorcem ter zvišanje ravni tekočine v vdolbini blistra, do najvišje še sprejemljive. S temi ukrepi lahko znatno izboljšamo občutljivost večine postopkov in študentje ali dijaki, ki jim to postavimo kot izziv npr. pri njihovem projektnem delu, se lahko ob tem zelo veliko naučijo.

Pripravila: Nataša Gros, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo