10. Določanje glukoze

PRINCIP

Pri segrevanju 3,5 - dinitrosalicilne kisline (DNS - reagent) v prisotnosti sladkorjev (glukoze) nastane rdečerjav produkt, 3 - amino, 5 - nitrosalicilna kislina. Intenzivnost razvite barve merimo s spektrofotometrom pri 540 nm.
 

PRIBOR IN REAGENTI

• raztopina 3,5 - dinitrosalicilne kisline (DNS -reagent)

Zatehtamo 10 g DNS in jo raztopimo v 200 mL 2 M  NaOH. Raztopino med stalnim, intenzivnim mešanjem segrevamo. Dodamo barvni stabilizator (raztopina natrijevega, kalijevega tartrata - raztopimo 300g natrijevega, kalijevega tartrata v 500 mL destilirane vode). Dobro premešamo ti dve raztopini in dopolnimo do 1 L z destilirano vodo.
 

PRIPRAVA VZORCA

1. Marmelada - celokupni sladkorji
   
   Zatehtamo 1 - 2 g vzorca marmelade v erlenmajerico z zamaškom. Dodamo 10 mL 1,5 M H₂SO₄ in v digestoriju segrevamo na vreli vodni kopeli 20 minut. Občasno premešamo, da pride do popolne hidrolize. Vzorec shladimo in previdno dodamo 12 mL 10 % NaOH. Premešamo in prefilitriramo v 100 mL merilno bučko in dopolnimo do 100 mL. Odpipetiramo 10 mL te raztopine v 100 mL merilno bučko in dopolnimo do 100 mL in ponovno dobro premešamo.
2. Marmelada - reducirajoči sladkorji
   
   Zatehtamo okoli 3 g marmelade v erlenmajerico, dodamo 50 mL destilirane vode, segrevamo in mešamo 10 minut. Prefilitramo v 100 mL merilno bučko. Erlenmajerico spremo z majhno količino destilirane vode in prelijemo v merilno bučko. Bučko dopolnimo do 100 mL. Odpipetiramo 10 mL te raztopine v 100 mL merilno bučko in dopolnimo do 100 mL in ponovno dobro premešamo. 

RAZVIJANJE BARVE IN MERITVE

Osnovna standardna raztopina glukoze

Zatehtamo 1,5 g glukoze, jo kvantitativno prenesemo v 100 mL merilno bučko, dopolnimo do 100 mL in dobro premešamo.   γ_(glu) = 15 mg/mL

Serija  delovnih raztopin za pripravo umeritvene krivulje

Pripravimo 5 merilnih bučk z volumnom 100mL in jih označimo. V bučke odpipetiramo 2, 3, 6, 8 in 10 mL (v vsako bučko eno količino) standardne raztopine glukoze. Z destilirano vodo dopolnimo do 100 mL in dobro pretresemo. Dobili smo raztopine sladkorja z masnimi koncentracijami 0,3mg/mL, 0,45 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,2 mg/mL in 1,5 mg/mL.

Pripravimo 6 epruvet. V prvo odpipetiramo  10 mL destilirane vode (slepi vzorec). V ostalih 5 epruvet odpipetiramo:

• po 1 mL raztopin za umeritveno krivuljo (masne koncentracije 0,3 mg/mL, 0,45 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,2 mg/mL in 1,5 mg/mL),
• po 1 mL DNS reagenta (3,5-dinitrosalicilne kisline),
• po 2 mL destilirane vode.

Epruvete segrevamo v vreli vodi 5 minut, da poteče reakcija med glukozo in DNS reagentom. Epruvete ohladimo in dodamo do 10 mL destilirane vode in dobro premešamo. Iz epruvet raztopine prelijemo v plastične stekleničke s pokrovčki za kapljanje in jih označimo.

Transmitanco merimo pri svetlobi z valovno dolžino 540nm.
Pri spektrometru Spektra^TM uporabimo zeleno svetilo. 

RAČUN

Koncentracijo glukoze v 100 g vzorca izračunamo:

g glukoze/100 g vzorca = odčitana γ glukoze v vzorcu · 10 · 100

10 = razredčitev
100 = volumen  raztopine 1g vzorca

MERITVE IN REZULTATI

Tabela 1: Kalibracijska krivulja - odvisnost absorbance od masne koncentracije           

 
Graf 1: Kalibracijska krivulja- odvisnost A od masne koncentracije      

Razvili in pripravili: Alma Kapun Dolinar in Irena Štrumbelj Drusany, Srednja agroživilska šola Ljubljana