11. Določanje kazeina z biuret-metodo

V živilski industriji so postopki predelave in živilski produkti izpostavljeni najvišjim možnim zahtevam kontrole kakovosti. Za jamčenje kakovosti določenega produkta je zelo pomembno poznavanje njegove sestave. To še posebej velja za naravne proizvode, kot je na primer mleko in predelava mleka v različne mlečne izdelke kot so skuta, sir, jogurt..

Mleko vsebuje pomemben naravni protein, kazein, ki je bistven pri procesu sirjenja med pridelavo sira. Kazein omogoča nastanek različnih vrst sirov. Učinkovit nadzor procesov pridelave mlečnih produktov je tako možen šele, ko je znana koncentracija kazeina v mleku. Ravno tako je vsebnost kazeina pomemben podatek in pokazatelj kakovosti pri skuti in sirih.

Kvantitativno določanje kazeina z biuret-metodo je klasična metoda analize proteinov. Temelji na biuret reakciji in omogoča določanje proteinov v raztopini preko obarvanega bakrovega kompleksa.

OSNOVA METODE

Proteini tvorijo v prisotnosti bakrovega sulfata v bazičnem okolju vijoličen bakrov kompleks. Ta barvni kompleks je lahko določen spektrometrično pri 540 nm valovne dolžine v vidnem območju spektra.

Količina tvorjenega kompleksa je dovolj velika, da lahko uporabimo biuret-metodo za kvantitativno določanje proteinov. Pod pogoji, pri katerih velja Beer-Lambertov zakon, se lahko za določitev uporabi izračun linearne odvisnosti.

REAGENTI

Biuretni reagent:
1,5 g bakrovega sulfata in 6 g kalijevega tartarata raztopimo v 500 mL destilirane vode. Dodamo 300 mL 10% NaOH

Priprava standardnih raztopin:
Kazein raztopimo v 3% raztopini NaOH.

NEVARNOSTI

Natrijev hidroksid (NaOH) R 35 Ukrepi za prvo pomoč: Pri vdihavanju: Prizadeto osebo prenesti na sveži zrak. Če simptomi ne prenehajo, poiskati zdravniško pomoč. Pri stiku s kožo: Onesnaženo obleko odstraniti. Prizadete dele kože sprati z obilo vode in mila. Če simptomi draženja ne prenehajo, poiskati zdravniško pomoč. Pri stiku z očmi: Oči takoj sprati z obilo vode, najmanj 15 minut. Veke držati odprte s pomočjo palca in kazalca. Se posvetovati z zdravnikom. Pri zaužitju: Ne izzivati bruhanja. Ustno votlino spirati z vodo. Poiskati zdravniško pomoč.

Bakrov sulfat (CuSO4) R 22-36/38-50/53 Ukrepi za prvo pomoč: Pri vdihavanju: Prizadeto osebo prenesti na sveži zrak. Če simptomi ne prenehajo, poiskati zdravniško pomoč. Pri stiku s kožo: Prizadete dele kože sprati z vodo in milom. Pri stiku z očmi: Oči takoj sprati z obilo vode, najmanj 15 minut. Veke držati odprte s pomočjo palca in kazalca. Se posvetovati z zdravnikom. Pri zaužitju: Takoj poiskati zdravniško pomoč.

UMERITVENA KRIVULJA

• Pripravimo pet standardnih raztopin z vsebnostjo kazeina (glej tabelo):
  
  1, 2,5, 5,0, 7,5 in 10,0 mg/mL.

• V epruvete dodamo 1 mL standardne raztopine in 4 mL biuretnega reagenta. Dobro premešamo in termostatiramo na 37°C - 20 minut.
• V ustrezen blister s pomočjo kapalnih stekleničk dodamo po 8 kapljic pripravljenih standardnih raztopin. Pri valovni dolžini 540 nm (zelena LED), s pomočjo spektrometra Spektra^TM izmerimo transmitanco proti slepemu vzorcu.
  
  Slepi vzorec:
  Dodamo 1 mL 3% NaOH + 4 mL biuretnega reagenta - premešamo in termostatiramo na 37°C - 20 minut - enako kot vzorec in standarde.

PRIPRAVA VZORCA

Natehtamo 2 g skute (na 0,001 g natančno) in jo raztopimo v 100 mL 3% NaOH. Dobro premešamo , da se skuta popolnoma raztopi in raztopino prefiltriramo skozi naguban filter papir. Odpipetriramo 1 mL vzorca in dodamo 4 mL biuretnega reagenta. Postopamo enako kot pri pripravi standardov in slepih vzorcev.

Iz umeritvene krivulje odčitamo koncentracijo kazeina v skuti.

REZULTATI

Datum:

Pripravila: Alenka Hmelak gorenjak, Živilska šola Maribor