Merjenje koncentracije proteinov v serumu

TEORETIČNE OSNOVE

Proteini v serumu so prisotni v visokih koncentracijah, njihova vloga pa je raznolika. Ker so proteini mešanica albuminov in globulinov, nimajo enotne molekulske mase in zato njihove koncentracije ne moremo izraziti v mol/L, temveč v g/L. Proteine v serumu ugotavljamo z biuretnim reagentom, produkt reakcije pa je vijolično obarvan. Spektrometrično metodo z biuretskim reagentom imenujemo biuret metoda.

PRINCIP

Ime biuret metoda izvira iz besede biurea. Biurea nastane, če segrevamo ureo pri temperaturi 180 °C.

Urea in biurea

Biurea v prisotnosti Cu²⁺ ionov, ki so sestavni del biuretnega reagenta, v alkalni sredini tvori vijolično obarvani kompleks. Enako barvno reakcijo dajejo tudi proteini in peptidi, ki imajo vsaj dve peptidni (-CONH) vezi.

Intenziteta nastale barva je premosorazmerna koncentraciji beljakovin v serumu.

Referenčne vrednosti beljakovin v serumu so od 65 do 80 g/L.

PRIBOR IN REAGENTI

pipete, čaše,
centrifugirke, alkoholni flomaster,
vzorec seruma: kontrolni goveji serum za biokemijo, naročilo pri Sanolabor, proizvajalec Randox,
standardna raztopina beljakovin,
koncentrirani biuretni reagent

PRIPRAVA:
4,5 g KNa tartrat
40 mL 0,2 M NaOH
1,5 g CuSO₄ · 5 H₂O
0,5 g KJ
in dopolnimo z 0,2 M NaOH do 100 mL,

raztopina za redčenje

PRIPRAVA:
5 g KJ
dopolnimo z 0,2 M NaOH do 1000 mL,
spektrometer SPEKTRA^TM

Delovni reagent je razredčeni biuretni reagent, ki ga pripravimo tako, da biuretni reagent redčimo z raztopino za redčenje v razmerju 1 : 5 ali 1 + 4.

NEVARNOSTI

	KNa tartrat: ta snov ni razvrščena kot nevarna snov v skladu z zakonodajo Evropske unije
	NaOH: povzroča hude opekline kože in poškodbe oči, lahko je jedko za kovine R: 35 S: 26, 36/37/39, 45
	CuSO₄ · 5 H₂O: zdravju škodljivo pri zaužitju, povzroča hudo draženje oči, povzroča draženje kože, zelo strupeno za vodne organizme, zelo strupeno za vodne organizme z dolgotrajnimi učinki R: 22, 36/38, 50/53 S: 22, 60, 61

	KJ: ta snov ni razvrščena kot nevarna snov v skladu z zakonodajo Evropske unije

POSTOPEK

Pripravimo preračunan volumen delovnega reagenta.

Epruvete ustrezno označimo in pipetiramo:

reagenti	slepi vzorec (sl)	standard (st)	vzorec (vz)
delovni reagent	400 µL	400 µL	400 µL
standardna razt. belj.	-	10 µL	-
vzorec (serum)	-	-	10 µL
prečiščena voda	10 µL	-	-

Zmesi premešamo in pustimo 30 min pri sobni temperaturi, da reakcija poteče. Spektrometer umerimo s slepim vzorcem na transmitanco100,0% in izmerimo transmitanco standarda in vzorca pri valovni dolžini 546 nm oz. uporabimo zeleno svetilo. Nato izračunano absorbanco za vse primere.

Izračunamo koncentracijo vzorca po formuli: C_vz = A_vz ·	C_st
	A_st

C_vz - koncentacija vzorca
A_vz - absorbanca vzorca
C_st - koncentracija standarda
A_st - absorbanca standarda

PODATKI, IZMERJENE VREDNOSTI IN IZRAČUN

C_st = _____________

T_st (izmerjeno)= _____________ A_st (izračunano)= _____________

T_vz (izmerjeno)= _____________ A_vz (izračunano)= _____________

Izračun konc. proteinov: _____________

REZULTAT: C_vz = _____________

PRAVA VREDNOST (podatek poda proizvajalec kontrolnega govejega seruma za biokemijo, naročilo pri Sanolabor, proizvajalec Randox): _____________

% napake = _____________

Pripravila: Sabina Povhe Lenart, Srednja šola za farmacijo, kozmetiko in zdravstvo, Ljubljana