PRETOČNI SISTEM ZA SPREMLJANJE KEMILUMINISCENČNE REAKCIJE

Osnova

Reakcija med luminolom in vodikovim peroksidom je primer kemiluminiscenčne reakcije, ki poteka ob prisotnosti kovinskih ionov kot katalizatorja. Pri kemiluminiscenčnih reakcijah se energija sprošča v obliki svetlobe. Ker se moč izsevane svetlobe spreminja s koncentracijo vodikovega peroksida, je na tej osnovi mogoče določati koncentracijo vodikovega peroksida ali koncentracijo snovi, ki pri reakcijah tvorijo vodikov peroksid. Primer reakcije, pri kateri nastane vodikov peroksid, je npr. encimska pretvorba glukoze z glukozno oksidazo. Določanje glukoze v krvi in urinu je pomembno za prepoznavanje in nadzor nad sladkorno boleznijo, za katero v razvitem svetu zboleva vse več ljudi.

Naloga

Cilj aktivnosti je zgraditi preprost pretočni sistem za spremljanje luminiscenčne reakcije s spektrometrom Spektra^TM in poiskati zvezo med močjo izsevane svetlobe in koncentracijo vodikovega peroksida.

Potrebščine

Pri delu rabimo:

• spektrometer Spektra^TM,
• tehtnico,
• tehtalno ladijco,
• merilno bučko 500 mL,
• merilno bučko 250 mL (2x),
• merilno bučko 200 mL,
• merilno bučko 100 mL (4x),
• stekleno palčko,
• pipete za odmerke od 0,05 mL do 2 mL,
• čašo 250 mL,
• čašo 150 mL,
• čašo 25 mL (4x),
• merilni valj 10 mL,
• mikropretočno celico, ki jo izdelamo iz dveh folij Shrinky Dinks Crystal Clear in Shrinky Dinks Brown folije, K & B Innovations, North Lake, ZDA,
• silikonske cevke Clear C-FLEX, zunanjega premera 2,1 mm, notranjega premera 0,5 mm, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hils, Illions, ZDA,
• presesalno bučo z gumijastim zamaškom (2x),
• cevke različnih premerov,
• ravno stekleno cevko s petelinčkom,
• ravno stekleno cevko,
• stekleno cevko s kolenom,
• vodno črpalko.

Kemikalije

Pri delu rabimo naslednje kemikalije:

• natrijev karbonat,
• natrijev hidrogen karbonat,
• amonijev karbonat,
• luminol, ( 3-aminoftalhidrazid),
• kobaltov(II) klorid heksahidrat,
• vodikov peroksid (w=30%, ρ=1,1 kg/L).
  

Nevarnosti

	Natrijev karbonat R 36 Draži oči. S 22-26 Ne vdihavajte prahu. Če pride v oči sperite z veliko vode.
	Natrijev hidrogen karbonat /
	Amonijev karbonat R 22 Škodljiv ob zaužitju.
	Luminol R: 36/37/38 Draži oči, dihala in kožo. S: 26-36 V primeru stika z očmi, takoj sperite z veliko vode in poiščite zdravniško pomoč. Nosite zaščitno obleko.
	Kobaltov(II) klorid heksahidrat R 49-60-42/43-50/53-68 Pri vdihavanju lahko povzroči raka. Zelo strupen za vodne organizme, lahko povzroči dolgotrajne učinke na vodno okolje. Možne trajne okvare zdravja. S 53-22-36/37-45-61 Izogibajte se daljšemu izpostavljanju. Ne vdihavajte prahu. Nosite primerno zaščitno obleko in rokavice. Ne izpuščajte v okolje.
	Vodikov peroksid R: 34 Povzroča opekline. S: 45-36/37/39-3-26 V primeru nesreče ali slabem počutju, takoj poiščite zdravniško pomoč. Nosite primerno zaščitno obleko, zaščitne rokavice in zaščito za oči/ obraz. Hranite na hladnem. V primeru stika z očmi, takoj izperite z obilo vode in poiščite zdravniško pomoč.

Postopki

Priprava raztopine luminola
V 250 mL čašo odmerimo 125 mL prečiščene vode, dodamo 1 g Na₂CO₃ in 0,05 g luminola ter mešamo, da se vse raztopi. Nato dodamo 6 g NaHCO₃ in 0,125 g amonijevega karbonata ter 0,025 g kobaltovega klorida heksahidrata. Raztopino kvantitativno prenesemo v 250 mL merilno bučko in jo razredčimo s prečiščeno vodo do oznake.

Priprava raztopin vodikovega peroksida različnih koncentracij
Iz 30 % raztopine vodikovega peroksida (r=1,1 kg/L) pripravimo raztopine z različnimi koncentracijami, kot je povzeto v tabeli 1.

Tabela 1: Priprava raztopin z različno koncentracijo vodikovega peroksida

Izdelava mikropretočne calice
S škarjami izrežemo tri enake šestkotnike, in sicer dva iz brezbarvne, prozorne folije in enega iz rjave za svetlobo nepropustne folije Shrinky Dinks. Iz rjavega šestkotnika v podolžni smeri po sredini izrežemo daljši 5 mm širok kanal, ki se na eni strani razcepi v dva 2,5 mm široka kanala v obliki črke Y, kot je prikazano na sliki 1.

Slika 1. Oblika šestkotnika, ki ga izrežemo iz folij Shrinky Dinks, z nakazanimi kanali v obliki črke Y, ki jih izrežemo iz rjave za svetlobo nepropustne folije.

Vse tri šestkotnike zložimo enega na drugega tako, da se prekrivajo in je rjavi šestkotnik v sredini med obema prozornima. Vse tri plasti zlepimo z malo sekundnega lepila, ki ga nanesemo na folije ob ogliščih lika in ob koncih kanalov, ter lik obtežen sušimo 15 minut. Nato lik termično spojimo v sušilniku pri 160 °C, pri čemer se le-ta skrči po dolžini in širini poveča pa se njegova debelina. S svedrom premera 2,1 mm skozi stranski rob izvrtamo luknje in kanale odpremo navzven tako, da lahko priključimo silikonske cevke Clear C-FLEX .

Pretočni sistem
Mikropretočno celico položimo v merilno komoro spektrometra Spektra^TM tako, da je ravni del kanala, ki sledi razcepu, nad merilnim mestom. Položaj mikropretočne celice učvrstimo z lepilnim trakom. V gumijast zamašek, skozi katerega sta prevrtani dve izvrtini, vstavimo ravno stekleno cevko, ter stekleno cevko s petelinčkom. Zamašek vstavimo v prvo presesalno bučo in stekleno cevko brez petelinčka spojimo z gumijasto cevjo z drugo presesalno bučo. V gumijast zamašek druge presesalne buče, skozi katerega je izvrtana izvrtina, vstavimo stekleno cevko s kolenom. Konec te cevke spojimo s silikonsko cevko, ki jo na drugi strani priključimo na izhod ravnega kanala mikropretočne celice. Na vhodna dva kanala mikropretočne celice priključimo silikonski cevki, ki vodita v 25 ml čaši, od katerih eno napolnimo z raztopino luminola, drugo pa z raztopino H₂O₂. Tako sestavimo pretočni sistem. Ko prvo presesalno bučo povežemo z vodno črpalko, bo iz rezervoarjev skozi mikropretočno celico sesalo reagenta, ki bosta reagirala v pretoku. Kemiluminescenčno reakcijo spremljamo s spektrometrom Spektra^TM. Svetilni del spektrometra tukaj nima vloge, saj želimo meriti svetlobo kemiluminiscenčne reakcije. Delamo pri največji elektronski ojačitvi, ko sta potenciometra v skrajnem desnem položaju. Mikropretočno celico prekrijemo s škatlico iz črnega papirja, da preprečimo moteči vpliv okoliške svetlobe. Pretočni sistem za spremljanje kemiluminiscenčne reakcije je prikazan na sliki 2.

Slika 2: Pretočni sistem za spremljanje kemiluminiscenčne reakcije s spektrometrom Spektra^TM.

Merjenje intenzitete svetlobe kemiluminiscenčne reakcije
Vhodni cevki mikropretočne celice potopimo v 25 ml čaši, napolnjeni s prešiščeno vodo in začnemo skozi pretočni sistem sesati prečiščeno vodo. S petelinčkom uravnamo pretok tako, da je hitrost sesanja vode iz posameznega rezervoarja 2,5 ml/min, kar lahko natančneje ugotovimo tako, da eno od čaš nadomestimo z merilnim valjem napolnjenim s prečiščeno vodo. Nato čaši s prečiščeno vodo nadomestimo s čašo z raztopino luminola in čašo z raztopino vodikovega peroksida najnižje koncentracije in odčitamo merilno vrednost. Nadaljujemo tako, da po vsaki meritvi speremo sistem s prešiščeno vodo in nato naredimo poskus z luminolom in naslednjo raztopino vodikovega peroksida višje koncentracije. Odzive spektrometra vpisujemo v tabelo, kot je prikazano v tabeli 2.

Rezultati

V tabeli 2 in na sliki 3 je primer rezultatov.

Tabela 2: Intenziteta svetlobe kemiluminiscenčne reakcije za različne koncentracije vodikovega peroksida

Slika 3: Odvisnost intenzitete svetlobe luminiscenčne reakcije od koncentracije vodikovega peroksida.

Razlaga

Intenziteta svetlobe luminiscenčne reakcije narašča s koncentracijo vodikovega peroksida v koncentracijskem območju do 0,1 mol/L. Za nizke milimolarne koncentracije vodikovega peroksida je mogoče domnevati, da bi bila v omejenem koncentracijskem območju zveza linearna, kar je najbolj zaželeno za določanje koncentracij. S pretočnim sistemom za spremljanje kemiluminiscenčnih reakcij bi bilo mogoče določati nizke koncentracije vodikovega peroksida.

Razvili in pripravili: Dr. Nataša Gros in Karmen Lampreht, Univerze v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo