Wykorzystanie technik chromatograficznych do oceny stopnia zanieczyszczenia gleby wielopierścieniowymi węglowodorami aromatycznymi (WWA).

Cel

Wyizolowanie frakcji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) z gleby o różnym stopniu zanieczyszczenia i oznaczenie zawartości poszczególnych jej składników.

Wprowadzenie

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) to grupa związków chemicznych wykazujących wysoką toksyczność, w tym zdolność niektórych z nich do wywoływania zmian nowotworowych. Najbardziej rakotwórcze WWA to benzo(a)piren, benzo(a)antracen, dibenzo(a,h)antracen, benzo(b)fluoranten benzo(k)fluoranten i indeno(1,2,3-c,d)piren. WWA są metabolizowane w organizmie do związków tworzących trwałe połączenia z DNA (np. epoksydowe pochodne), co w konsekwencji może prowadzić do wysoce prawdopodobnego procesu nowotworzenia.

Wybrane wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne.

WWA występują w środowisku zawsze jako mieszaniny wieloskładnikowe, których skład zależy od źródła pochodzenia. Powstają jako produkty niepełnego spalania paliw kopalnych, w trakcie utylizacji odpadów oraz jako wynik działalności przemysłu ciężkiego, związanego z przetwarzaniem węgla i ropy naftowej. Najpoważniejszym źródłem WWA na terenach zurbanizowanych jest transport samochodowy. Również poważnym źródłem WWA, zwłaszcza w okresie zimowym, jest indywidualne ogrzewanie budynków.

W glebach występuje blisko 90% całkowitej ilości wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych znajdujących się w środowisku.

WWA w glebie występują w ilościach śladowych (na poziomie ppm i ppb), stąd oznaczanie ich wymaga wieloetapowej procedury. Prawidłowe wykonanie każdego etapu ma zasadnicze znaczenie dla poprawności wyników badań, zwłaszcza tych etapów, których nie można skorygować w dalszym toku analizy.

Aby wyizolować węglowodory z gleby stosuje się ekstrakcję cieczą. Do ekstrakcji WWA z gleby stosuje się rozpuszczalniki, w których dobrze rozpuszczają się węglowodory, są to najczęściej: n-heksan, cykloheksan, toluen, dichlorometan, aceton oraz ich mieszaniny.

W ekstrakcie z gleby znajdują się głównie związki niepolarne jak węglowodory oraz w zdecydowanie mniejszej ilości związków polarnych. W glebach nieskażonych są to głównie łańcuchowe węglowodory nasycone pochodzenia roślinnego, w skażonych - mieszanina nasyconych i aromatycznych o stosunku ilościowym zależnym od stopnia skażenia.

Do wydzielenia frakcji WWA z ekstraktu stosuje się bardzo często cieczową chromatografię adsorpcyjną, w której rozdział następuje dlatego, że poszczególne składniki mieszaniny wykazują różnice w adsorpcji zachodzącej na aktywnych powierzchniach adsorbentu (w chromatografii nazywanego fazą stacjonarną). Im substancje wykazują większe powinowactwo do adsorbentu tym bardziej są na nim zatrzymywane i później opuszczają kolumnę chromatograficzną. Oznacza to większą ilość rozpuszczalnika (fazy ruchomej) potrzebną do wymycia ich z kolumny (w chromatografii mówimy o większej objętości retencji). Często oddziaływania niektórych składników mieszaniny z adsorbentem są na tyle silne, że trzeba użyć innego rozpuszczalnika(ów) o większej mocy wymywania (większej sile elucji).

Żel krzemionkowy jest adsorbentem nieorganicznym. Na jego powierzchni znajdują się aktywne grupy silanolowe ( ≡ Si-OH) odpowiedzialne za adsorpcję. Ponieważ grupy silanolowe łatwo adsorbują cząsteczki polarne, np. wodę, co zmniejsza aktywność żelu, do rozdziału węglowodorów alifatycznych od aromatycznych stosuje się aktywowany żel krzemionkowy, tzn. pozbawiony wody zaadsorbowanej na jego powierzchni.

Identyfikację i oznaczanie ilościowe WWA wykonuje się m. in. techniką chromatografii gazowej (GC). W chromatografii gazowej rozdział mieszaniny substancji następuje w wyniku różnicy powinowactwa poszczególnych jej składników do fazy stacjonarnej, którą jest wysokowrząca ciecz lub ciecz związana chemicznie z nośnikiem oraz w wyniku różnicy w lotności (temperatur wrzenia) poszczególnych składników.

Uniwersalnym detektorem stosowanym w analizach węglowodorów jest detektor płomieniowo-jonizacyjny.

Odczynniki

• żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm,
• eter naftowy cz.d.a.,
• toluen cz.d.a.,
• dichlorometan cz.d.a.,
• bezwodny siarczan sodu cz.d.a..
  

Materiały i aparatura

• łyżka metalowa - 1 szt,
• naczynia szklane na próbki gleby,
• moździerz porcelanowy - 1 szt.,
• naczynka wagowe o pojemności 5-10 ml, 2 szt.,
• kolba stożkowa o poj. 25 ml 2 szt,
• kolba stożkowa o poj. 100 ml 3 szt,
• lejek szklany - 2 szt,
• sączki z bibuły filtracyjnej,
• kolbki gruszkowe poj. 100 ml - 2 szt,
• pipeta z tłoczkiem lub strzykawka szklana o poj. 2 ml - 2 szt,

• kolumna szklana z kranikiem, średnica wewnętrzna 1 cm, minimalna długość 15 cm,

• cylindry miarowe o poj. 10 ml - 1 szt., 25ml - 2 szt., 50ml - 1 szt,
• kolbki gruszkowe poj. 50 ml - 2 szt.

Zagrożenia

Procedura

Pobrać 2 próby gruntu z głębokości 0-5 cm, każdą o masie ok. 50 g. Próby należy pobrać metalową łopatką do szklanych pojemników z zamknięciem. Jedna próbkę gleby należy pobrać z terenu nieskażonego, np. parku, drugą z miejsca narażonego bardzo na skażenie, np. parkingu.

Glebę po przyniesieniu do laboratorium rozłóż cienką warstwą na bibule filtracyjnej, suwając duże cząstki roślinne i kamienie, i zostaw w ciemnym miejscu do wysuszenia do powietrznie suchej.

Wyznacz suchą masę gleby. W tym celu odważ na wadze analitycznej do wytarowanych naczynek wagowych naważki gleby ok. 2-3 g z dokładnością do 1 mg, wstaw do suszarki ustawionej na 105ºC i susz do stałej masy.

Oblicz procentową zawartość wody w powietrznie suchej glebie:

% H₂O = 100% x (m_{gleby powietrznie suchej}[g] - m_{gleby po wysuszeniu}[g])
/ m_{gleby powietrznie suchej}[g]

Odważ próbkę o masie ok. 5 g (±0,01g) z gleby skażonej i ok. 25 g (±0,01g) gleby nieskażonej. Naważki gleb umieść w odpowiednio opisanych kolbkach stożkowych o pojemności 100 ml, dodaj po 50 ml mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu (3:2, v:v). Kolbki umieść w łaźni ultradźwiękowej na 15 min lub mieszaj na mieszadle magnetycznym 20 min. Następnie osad dekantuj, ekstrakt przesącz przez bezwodny siarczan sodu umieszczony na sączku z bibuły filtracyjnej do kolbki gruszkowej o pojemności 100 ml. Do gleby dodaj świeżą porcję (25 ml) mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu i ekstrahuj w łaźni ultradźwiękowej 10 min, na mieszadle magnetycznym - 15 min, następnie połącz ekstrakty tych samych próbek, przesączając przez ten sam sączek. Do połączonych ekstraktów dodaj 0,2 ml toluenu i odparuj na odparowywaczu obrotowym przy temperaturze łaźni wodnej nie przekraczającej 30ºC do objętości dodanego toluenu (warstwa „oleju” na ściankach kolbki). Do ekstraktu dodaj 0,5 ml eteru naftowego. W razie trudności w rozpuszczeniu ekstraktu lekko podgrzej zawartość kolbki w łaźni wodnej, w ostateczności próbkę nanieś na kolumnę w postaci zawiesiny.

W kolbkach o pojemności 25 ml odważ dwie porcje żelu krzemionkowego o masie 2,5 g każda i wstaw do suszarki o temperaturze 150ºC na 8 godzin. Kolbki zamknij a po ostygnięciu dodaj do każdej tyle eteru naftowego aby słup cieczy nad zawiesiną wynosił ok. 1 cm. Zawartość kolbki mieszaj ruchem łagodnym, tak by usunąć z zawiesiny pęcherzyki gazu. Zabezpiecz zawartość kolbki przed odparowaniem rozpuszczalnika do czasu rozdziału chromatograficznego.

W kolumnie chromatograficznej umieść na przegrodzie ze szkła spiekanego krążek bibuły filtracyjnej. Następnie podstaw naczynie na rozpuszczalnik z przemywania kolumny. Jedną porcję żelu krzemionkowego lekko wymieszaj i wlej przez lejek do kolumny unikając zbędnego napowietrzania. Po napełnieniu i ułożeniu adsorbentu w kolumnie na wierzch złoża nałóż krążek bibuły, następnie przemyj zawartość kolumny 6 ml eteru naftowego ( lub więcej aż do osiągnięcia stałej wysokości złoża w kolumnie, które powinno mieć wysokość ok. 6 cm ) i zamknij wypływ z kolumny.

Należy pamiętać, by warstwa adsorbentu była stale pokryta rozpuszczalnikiem!

Jeśli ekstrakt był podgrzewany schłódź go do temperatury pokojowej. Wypuść z kolumny nadmiar eteru naftowego, tak by wysokość cieczy nad złożem wynosiła 1-2 mm. Nanieś roztwór analizowany na czoło kolumny, wlewając go powoli pipetą lub strzykawką najlepiej po ściance kolumny tuż nad powierzchnią żelu. Podstaw pod kolumnę cylinder miarowy o pojemności 25 ml.

Od momentu naniesienia ekstraktu na kolumnę rozpoczyna się zbieranie frakcji!

Gdy ekstrakt znajdzie się w złożu a wysokość cieczy nad złożem wyniesie ok. 1-2 mm wlej ostrożnie po ściance kolumny 1 ml eteru naftowego i odczekaj aż wysokość cieczy nad złożem wyniesie ok. 1-2 mm, jak poprzednio. Czynność tę powtórz jeszcze raz, używając następną, 1 ml porcję eteru naftowego. Gdy składniki ekstraktu są zaadsorbowane na złożu, dodaj pozostałą objętość eteru naftowego, wynikającą z rozmiarów złoża i warunków rozdziału podanych poniżej i prowadź wymywanie frakcji węglowodorów alifatycznych. Następnie zmień fazę ruchomą wg warunków rozdziału podanych poniżej (podstaw drugi cylinder na frakcję WWA).

W czasie przygotowywania kolumny i rozdziału chromatograficznego możesz przyspieszyć przepływ fazy ruchomej stosując lekkie nadciśnienie lub podciśnienie.

Warunki rozdziału

• żel krzemionkowy aktywowany,
• wymiary złoża żelu krzemionkowego w kolumnie - 1 cm x 6 cm;
• objętość zebranej frakcji I wymywanej eterem naftowym, zawierającej węglowodory alifatyczne - 12 ml,
• objętość zebranej frakcji II wymywanej mieszaniną eteru naftowego i toluenu (9:1,v:v), zawierającej węglowodory aromatyczne - 25 ml.

Jeśli wysokość złoża adsorbentu jest inna niż 6 cm, objętości zbieranych frakcji zmień proporcjonalnie.

Frakcję WWA przenieś do kolbki gruszkowej o pojemności 50 ml i zatęż na odparowywaczu obrotowym do obj. ok. 1 ml i przechowuj do czasu analizy GC zamkniętą w lodówce, owijając kolbkę folią aluminiową.

W identyczny sposób wydziel frakcję WWA z drugiego ekstraktu, używając do tego drugą (świeżą) porcję aktywowanego żelu krzemionkowego.

Analiza właściwa WWA

Wydzielone frakcje WWA, po dodaniu odpowiedniej ilości 2-metyloantracenu jako odnośnika do oznaczeń ilościowych, zostaną zanalizowane metodą chromatografii gazowej w Katedrze Analizy Środowiska.

Wyniki w postaci chromatogramów gazowych:

1. Chromatogram gazowy frakcji WWA izolowanej z próbki gleby z parkingu,
2. Chromatogram gazowy frakcji WWA izolowanej z próbki gleby z parku,
3. Chromatogram gazowy roztworu wzorcowego WWA

zostaną przekazane uczniom do interpretacji i obliczeń.

Odczytaj czas w jakim pojawiają się sygnały poszczególnych WWA (tzw. czas retencji) na chromatogramie roztworu wzorcowego (3). W tabeli 1 podano współczynniki detekcji poszczególnych WWA, potrzebne do obliczeń ilościowych. Na podstawie czasów retencji zidentyfikuj sygnały poszczególnych węglowodorów na chromatogramach 1 i 2, następnie zmierz wysokości zidetyfikowanych sygnałów chromatograficznych. Wyniki zapisz w tabelce 1.

Oblicz zawartość poszczególnych WWA we frakcji wg wzoru:

m_analitu(i) = m_wz.wewn. x f_analitu(i) x W_analitu(i) / W_wz.wewn

gdzie:
m_analitu(i) - masa poszczególnego WWA we frakcji,
m_wz.wewn. - masa wzorca wewnętrznego dodanego do frakcji,
f_analitu(i) - współczynnik detekcji poszczególnego WWA,
W_analitu(i) - wysokość sygnału chromatograficznego poszczególnego WWA [mm] na chromatogramie frakcji,
W_wz.wewn - wysokość sygnału chromatograficznego wzorca wewnętrznego [mm] na chromatogramie frakcji.

Tabela 1. Wyniki pomiarów zawartości WWA w próbkach.

Przyjmując, że wydzielenie frakcji WWA odbyło się z 80% wydajnością i uwzględniając zawartość wody w glebie, oblicz ile poszczególnych WWA było w glebie badanej, wyrażając wynik w mg/kg s.m. gleby i zapisz do tabelki (s.m. = sucha masa).

Oblicz też sumę WWA w glebie w mg/kg s.m. gleby i zapisz do tabelki.

Porównaj uzyskane wartości ze standardami jakości gleby. Oceń stopień skażenia gleby.

Wartości dopuszczalne stężeń WWA w glebach określa Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 9 września 2002 r.w sprawie standardów jakości gleby oraz standardów jakości ziemi (Dz. U. Nr 165, 2002, poz. 1359). W Rozporządzeniu określa się standardy jakości gleby lub ziemi, z uwzględnieniem ich funkcji dla następujących grup rodzajów gruntów:

• grupa A: gleby chronione na podstawie przepisów ustawy Prawo wodne oraz przepisów o ochronie przyrody,
• grupa B: gleby rolnicze, leśne i zakrzewione, nieużytki, grunty zabudowane i zurbanizowane,
• grupa C: tereny przemysłowe, użytki kopalne, tereny komunikacyjne.

W Tabeli 2 przedstawiono standardy jakości gleb dla wybranych WWA w mg/kg suchej masy. Należy zauważyć, dla gleb grupy A nie uwzględnia się głębokości warstwy, natomiast w grupach gleb B i C dopuszczalne są różne stężenia WWA w zależności od głębokości jak również wodoprzepuszczalności gruntu, czego dla przejrzystości tabeli nie podano.

Tab. 2. Wartości odniesienia stężenia dziewięciu WWA (mg/kg s.m.) w warstwie powierzchniowej trzech rodzajów gleb.

Poprzez sumę WWA rozumie się sumę poziomu stężeń naftalenu, fenantrenu, antracenu, fluorantrenu, chrysenu, benzo(a)antracenu, benzo(a)pirenu, benzo(a)fluorantenu i benzo(ghi)perylenu. Wg rozporządzenia, glebę lub ziemię uznaje się za zanieczyszczoną, gdy stężenie co najmniej jednej z substancji przekracza wartość dopuszczalną.

Opracowanie: Faculty of Chemistry, University ob Gdansk, Poland